Ensaios ELISA
- Cubra as tiras de microtitulação com a proteína alvo diluída em 50 mM de solução-tampão de carbonato em pH 9.0. Concentrações ideais deverão ser determinadas por titulação, exceto para antígenos purificados.
- Remova a solução de antígeno. Acrescente 200 µl/poço de solução-tampão bloqueadora (PBS contendo BSA a 1% e azido a 0.02% )para bloquear ligações proteicas não específicas. Incube por 1–2 horas em temperatura ambiente ou durante a noite à temperatura de 4° C.
- Remova a solução-tampão bloqueadora. Lave um vez com PBS com azido a 0.02%. As tiras de micro poços ou as placas são em geral estáveis se estocadas em saco plásticos por até 4 semanas à temperatura de 4° C. Antes de usar, remova os excesso de líquido.
- Acrescente as amostras para teste de anticorpo e os controles na proporção de 50 µl/poço diluídas em solução-tampão bloqueadora. Os anticorpos deverão ser diluídos em série para determinar a titulação ou diluição, para que em seguida, possa-se calcular a concentração de trabalho para ensaios de rastreio ou quantificação do antígeno. Incube por 1 hora em temperatura ambiente.
- Lave as placas três vezes com PBS contendo Tween-20 0.05% (Tween-20: sc-29113), remova o excesso de líquido como descrito acima.
- Acrescente 50 µl/poço do anticorpo secundário conjugado a fosfatase alcalina diluído na proporção de 1:100–1:1000 em solução-tampão bloqueadora. A concentração ideal de anticorpo deverá ser determinada por titulação. Incube por 1 hora em temperatura ambiente.
- Remova o líquido dos poços. Lave três vezes em PBS contendo Tween-20 0.05% e sacuda a placa para secar.
- Lave os poços uma vez com solução-tampão de dietanolamina (10 mM dietanolamina, 0.5 mM MgCl2 (pH 9.5) e remova o líquido.
- Dilua o substrato (PNPP, sc-3720) em solução-tampão de dietanolamina para atingir a concentração final de 1 mg/ml. Acrescente 50 µl/poço. Permita a revelação entre 10–20 minutos ou até que o controle positivo atinja a OD de 405/490 de 1.0. Pare a reação acrescentando-se 50 µl de EDTA 0.1 M (EDTA: sc-29092), pH 7.5. Leia as placas no aparelho apropriado, microtiter leitor de placas de microtitulação na OD 405/490.