Semi-Quantitativo Nested-RT-PCR

OBSERVAÇÃO: OS valores Tm para os primers de PCR oferecidos pela Santa Cruz Biotecnologia Inc. variam entre 55–60 C (19–21 nt, GC% ~55%). Os pares de nested primers A e B são semelhantes em relação à extensão dos pares de bases, GC% e valores Tm.

OBSERVAÇÃO: Nested-PCR utiliza 2 pares de primers para PCR para um único sítio genético. O primeiro primer do par A amplifica no sítio. O segundo primer do par B (nested-primers), por sua vez, liga-se no amplicon A para produzir a segunda nested-amplicon B.

1. Síntese de cDNA

• Prepare uma solução contendo -
  1. 1 µl oligo (dT)_12-18 (500 µg/ml)
  2. 1 ng-5 µg de RNA total
  3. 1 µl 10 mM dNTPs
  4. e acrescente água RNase-free a um volume final de12 µl
• Incube à temperatura de 70° C durante 5 minutos para minimizar a estrutura secundária de RNA, resfrie rapidamente em gelo, e a seguir, acrescente -
  1. 4 µl de 5x solução- tampão de transcriptase reversa
  2. 2 µl de 0.1 M DTT
  3. 1 µl de inibidor de RNase
• Incube à temperatura de 42° C por 2 minutos para anelar o primer ao template (ou seja, DNA molde).
• Acrescente 1 µl de transcriptase reversa (200 unidades) e incube à temperatura de 42° C durante 50 minutos para estender o primer e em seguida terminar a reação através de incubação à temperatura de 70° C por 15 minutos.

Observação: (Como um passo opcional acrescente 1 µl de RNase H (2 Unidades/µl) e incube à temperatura de 37° C durante 20 minutos)

2. Primeira Reação de PCR

• Prepare uma solução contendo -
  1. 5 µl de 10x solução- tampão para PCR (com ou sem* MgCl₂)
  2. *5 µl 25 mM MgCl2 ( Poderá ser necessário variar a concentração de MgCl₂, recomenda-se a concentração final de 2.5 mM).
  3. 1 µl 10 mM dNTP
  4. 1 µl primer par A
  5. 1 µl Taq DNA polimerase
  6. 2 µl cDNA e acrescente água até 50 µl
• Incube à temperatura de 94° C durante 2 minutos para desnaturar o cDNA.
• Realize 15–40 ciclos de PCR. As condições de anelamento e extensão dependem do primer e do template e deverão ser determinadas empiricamente para cada par template-primer.

3. Segunda Reação de PCR

• Prepare uma solução contendo -
  1. 5 µl de 10x solução-tampão para PCR (com ou sem* MgCl₂)
  2. *5 µl 25 mM MgCl2 ( Poderá ser necessário variar a concentração de MgCl₂, recomenda-se a concentração final de 2.5 mM).
  3. 1 µl 10 mM dNTP
  4. 1 µl primer par B
  5. 1 µl Taq DNA polimerase
  6. 1-5 µl do primeiro produto PCR e água até 50 µl
• Incube à temperatura de 94° C por 2 minutos e desnature o DNA.
• Realize 15–40 ciclos de PCR . As condições para anelamento e extensão dependem do primer e do template, e deverão ser determinadas empiricamente para cada par template-primer.
• Os produtos do PCR são visualizados em géis de agarose corados com brometo de etídio.