Ensaios de Gel SuperShift TransCruz™
OBSERVAÇÃO: Faça o spin do oligonucleotídeos antes de abrir o frasco. O produto poderá ter se alojado na tampa do frasco.
- Marque o oligonucleotídeo sonda (Oligonucleotídeos TransCruz™ Gel Shift ) com [32P]-ATP a 50.000 cpm/ng usando-se a quinase para polinucleotídeos (para a lista desses reagentes e outros, veja os Produtos Químicos Laboratoriais Padrões).
- Prepare a solução-tampão para a reação do gel shift da seguinte maneira: f 10 mM Tris (Tris: sc-3715), 1 mM ditiotreitol (DTT: sc-29089), 1 mM EDTA (EDTA: sc-29092), 5% glicerol (glicerol: sc-29095).
- Prepare 20 µl da mistura de reação contendo 3–10 µg do extrato nuclear (Nuclear Extracts for Gel Shift and Western Blotting) e 1 µg poli dI-dC em solução-tampão de reação para gel shift. Acrescente 0.5 ng de oligonucleotídeos sonda marcados e incube por 20 minutos em temperatura ambiente. Essa será a amostra controle para detecção de complexos DNA-proteína.
- Para detectar o anticorpo supershift ou bloquear o complexo DNA-proteína , prepare a mistura de reação como descrita acima, acrescentando-se ainda 1–2 µl do anticorpo apropriado TransCruz™ Gel Supershift por 20 µl de volume de reação. O anticorpo é normalmente acrescentado depois da adição da sonda formada de oligonucleotídeos marcados, mas os resultados podem ser melhorados se o anticorpo for acrescentado antes da sonda. Incube à temperatura de 4° C pelo período de 1 hora a durante a noite, ou em temperatura ambiente por 15–45 minutos.
- Resolva os complexos DNA-proteína via eletroforese (25–35 ma) em gel de poliacrilamida a 4% contendo 50 mM Tris, pH 7.5, 0.38 M glicina (glicina: sc-29096) e 2 mM EDTA. Deixe o gel secar e visualize por autorradiografia.