Plasmídeo HDR para Transfecção e Plasmídeo CRISPR / Cas9 KO

Fase 1. Plasmídeo HDR para Transfecção e Plasmídeo CRISPR / Cas9 KO

Recomenda-se esse protocolo para um único poço de uma placa para cultura de 6 poços. Ajuste as quantidades de células e reagentes proporcionalmente ao número de poços ou placas para culturas de diferentes tamanhos.

• Em uma placa para cultura de 6 poços, coloque 1.5x 10⁵ - 2.5x 10⁵ células em 3 ml de meio para crescimento celular padrão sem antibiótico por poço, 24 horas antes da transfecção. Cresça as células a 40–80% de confluência. A quantidade de células inicial e a confluência após 24 horas são determinadas de acordo a taxa de crescimento da célula utilizada para a transfecção. Células saudáveis e subconfluentes são necessárias para o sucesso da transfecção com Plasmídeo HDR e nocaute (KO).
• Prepare as seguintes soluções:

  OBSERVAÇÃO: A proporção ideal do Plasmídeo DNA: UltraCruz® e Reagente de Transfecção deverá ser determinada experimentalmente iniciando-se com 1 µg de Plasmídeo DNA e entre 5–15 µl do UltraCruz® Reagente de Transfecção . Uma vez que o volume do Reagente de Transfecção é otimizado para minimizar a toxicidade celular, as concentrações do Plasmídeo DNA podem variar entre 1–3 µg por poço. Se o volume do Reagente de Transfecção UltraCruz™ for igual a 10 µl, então as concentrações do Plasmídeo DNA na faixa de 1–3 µg/10 µl deverão ser testadas. Por exemplo, teste as quantidades do reagente de transfecção Plasmídeo DNA/UltraCruz®: 1 µg/10 µl, 2 µg/10 µl, e 3 µg/10 µl. A quantidade apropriada do complexo reagente de transfecção e Plasmídeo DNA/ UltraCruz® usada por poço deverá ser testada para determinar a quantidade que resulta nos maiores níveis de eficiência de transfecção.

  OBSERVAÇÃO: Em caso de transfecção de mais de um plasmídeo (ou seja, CRISPR/Cas9 KO Plasmídeo com Plasmídeo HDR), misture o DNA Plasmídeo em equivalentes proporções.

  Solução A: Para cada transfecção, dilua 1–3 µg do plasmídeo DNA no meio de transfecção de plasmídeo: sc-108062  para obter um volume total de 150 µl. Pipete para cima e para baixo para misturar a solução. Deixe repousar por 5 minutos em temperatura ambiente.

  Solução B: Para cada transfecção, dilua 5–15 µl do reagente de transfecção UltraCruz®: sc-395739 com o meio de transfecção para plasmídeo: sc-108062  o suficiente para obter um volume final de 150 µl. Pipete para cima e para baixo para misturar a solução. Deixe repousar por 5 minutos em temperatura ambiente.

  OBSERVAÇÃO: Não acrescente antibióticos ao meio de transfecção de plasmídeo : sc-108062.

• Acrescente a solução de plasmídeo DNA (Solução A) gota a gota diretamente na solução de reagente de transfecção UltraCruz® (Solução B) usando uma pipeta. Vortex imediatamente e incube no mínimo por 20 minutos em temperatura ambiente./li>
• Antes da transfecção, troque o meio com o meio de cultura fresco sem antibiótico. Acrescente a quantidade de 300 µl do complexo Plasmídeo DNA/UltraCruz® Reagente de Transfecção (Solução A + Solução B) gota a gota em cada poço.
• Agite a placa de cultura gentilmente para misturar.
• Incube as células por 24–72 horas sob as condições normais utilizadas para cultura das células utilizadas. Não é necessário trocar o meio durante as primeiras 24 horas após a transfecção. Acrescente ou troque o meio caso necessário durante as 24–72 horas após a transfecção .
• Depois da incubação, o sucesso da transfecção de CRISPR/Cas9 KO Plasmídeo poderá ser visualmente confirmado pela detecção da Proteína Verde Fluorescente (GFP) via microscopia fluorescente e/ou Western blot com o anticorpo GFP (B-2): sc-9996. O sucesso da co-transfecçāo de CRISPR/Cas9 KO Plasmídeo e Plasmídeo HDR, poderá ser visualmente confirmado pela detecção da Proteína Vermelha Fluorescente (RFP) via microscopia fluorescente e/ou Western blot.
• Para células transfectadas com CRISPR/Cas9 KO Plasmídeo, analise as células 48–72 horas após a transfecção.
• Para células co-transfectadas com CRISPR/Cas9 KO Plasmídeo e Plasmídeo HDR vá para a fase 2.

OBSERVAÇÃO: Se a seleção com puromicina ou a transfecção de Vetor Cre não se aplicam, veja a fase 4.

Fase 2. Seleção com Puromicina

OBSERVAÇÃO: Se as células foram co-transfectadas com CRISPR/Cas9 KO Plasmídeo e Plasmídeo HDR, essas células poderão ser selecionadas com meio contendo puromicina.

• A concentração de trabalho da puromicina para células mamíferas varia entre 1–10 µg/ml. Antes de usar a puromicina (sc-108071), faça a titulação do agente de seleção para determinar a concentração ideal para a linhagem celular em uso. Use a concentração mais baixa capaz de eliminar 100% das células não transfectadas em 3–5 dias a partir do início da seleção com puromicina.
• 48–96 horas após a transfecção, aspire o meio e troque por meio de cultura fresco contendo puromicina na concentração adequada.
• Selecione as células por um mínimo de 3–5 dias. Aproximadamente a cada 2-3 dias, aspire e troque o meio por meio seletivo fresco recém-preparado.
• As células poderão ser analisadas nesse momento.
• Para a excisão do gene da puromicina, prossiga para a Fase 3.

Fase 3. Transfecção do Vetor Cre

Recomenda-se esse protocolo para as células selecionadas co-transfectadas com CRISPR/Cas9 KO Plasmídeo e Plasmídeo HDR, e para a remoção do material genético flanqueado pelos sítios LoxP.

OBSERVAÇÃO: Siga a Fase 1 do protocolo de transfecção de plasmídeo do Vetor Cre: sc-418923 transfecção.

Fase 4. Ensaio das Células

Para a análise completa do fenótipo/genótipo, pode ser necessário o isolamento de colônias originadas a partir de uma única célula para se confirmar o nocaute complete dos alelos.

• Para análise de proteínas, troque o meio pelo meio de cultura padrão (sem o antibiótico para seleção) 3 dias antes da lise celular. Para fazer a lise celular de células aderentes, aspire o meio, lave as células com PBS, raspe as células e as centrifugue em baixa rotação para formar o pellet. Para células em suspensão, transfira a cultura para um tubo de microcentrífuga e centrifugue as células em baixa rotação para formar o pellet. Lave com PBS e centrifugue novamente. Para células HEK 293 ou HeLa em 100% de confluência acrescente 100 µl de solução-tampão do sistema RIPA para lise celular  sc-24948 ao pellet. Para demais linhagens celulares ou confluências, a quantidade de solução-tampão do sistema RIPA para lise celular RIPA usada deverá ser determinada experimentalmente. Faça a sonicação celular ou a ruptura celular. Incube o lisado em gelo por 10 minutos, vortex, e incube novamente por 10 minutos no gelo. Faça a sonicação celular ou a ruptura celular. Incube o lisado em gelo por 10 minutos, vortex, e incube novamente por 10 minutos no gelo. Use o Kit BCA Proteína Assay Kit para determinar a concentração de proteína.
• Para análise via RT-PCR, isole RNA usando o método descrito por P. Chomczynski e N. Sacchi (1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156–159) ou usando um dos kits para isolamento de RNA disponíveis comercialmente.

Referências:
PMID: 24157548, PMID: 23287718