Coloração de Células para Imunofluorescência

A. Células de Cultura de Tecidos

• Cresça as células em laminas de vidro cobertas ou slides (Placas de Vidro Cobertas e Micro-slides para imunohistoquímica) durante a noite à temperatura de 37° C. Lave rapidamente com PBS (Soluções-tampão e Soluções Gerais) e fixe as células por um dos métodos descritos a seguir:
  1. 5 minutos em metanol à temperatura de -10° C, deixar secar ao ar (método recomendado); ou
  2. 2 minutos acetona gelada, deixar secar ao ar; ou
  3. 10 minutos em formalina a 1% em PBS (mantenha úmido).If fixing in formalin, we recommend you include a cell permeablization treatment. After fixing the cells, wash in three changes of PBS. Then incubate for 3 minutes in a solution of .01% Triton X-100 in PBS. Followed by a wash in three changes of PBS.
• Lave em 3 trocas de PBS.

B. Secções de Tecidos Congelados

• Congele o tecido em bloco em nitrogênio líquido de acordo com os procedimentos normais. O bloco poderá ser estocado à temperatura de -70° C por até duas semanas antes do seccionamento.
• Limpe os slides de vidro com 95% de etanol, e trate com solução para subbing e deixar secar ao ar. Ou use slides pré-tratados.
• Corte secções de 4- a 10-micron de espessura. Faça a adesão das secções aos slides em temperatura ambiente. Os slides poderão ser estocados à temperatura de -70° C. Descongele os slides em temperatura ambiente antes de fixar e corar.
• Faça a fixação dos slides em acetona gelada por 10 minutos e mantenha as mesmas refrigeradas (ou escolha outro método de fixação). Lave em 3 trocas de PBS (Soluções-tampão e Soluções Gerais).

<OBSERVAÇÃO: Para tecidos que contenham um alto nível de biotina endógena (o que pode resultar em alto níveis de manchas no fundo, contrastes, ou ainda "background staining"), recomenda-se a utilização do protocolo de fixação em formalina e embebidos em parafina para secções de tecidos , uma vez que a biotina endógena é geralmente destruída em tecidos embebidos em parafina.

C. Secções de Tecidos Fixados em Formalina, e Embebidos em Parafina.

• Fixe as secções de tecidos em formalina e prossiga com os procedimentos para formar os blocos embebidos em parafina de acordo com os protocolos padrões.
• Limpe os slides de vidro com 95% de etanol, e trate com solução para subbing e deixe secar ao ar. Ou use slides pré-tratados.
• Corte o tecido em secções de 4–6 mícron de espessura, e coloque-as nos slides . Retire a parafina em xilenos usando três trocas de 5 minutos cada uma. Reidrate as secções gradualmente através de álcoois em diferentes concentrações: lave em etanol 100% duas vezes por 15 minutos cada lavagem, seguido de duas lavagens em etanol 90% por 15 minutos cada lavagem. Lave em H₂O deionizada por 1 minuto sob agitação. Aspire o excesso de líquido dos slides.

Opcional: a exposição do antígeno poderá ser realizada neste momento. Alguns determinantes antigênicos são escondidos pela fixação em formalina e pelos procedimentos de embedamento em parafina e poderão ser expostos por um dos métodos descritos abaixo.

1. Tratamento por Calor (método recomendado): Coloque os slides em um vasilhame e cubra com 10 mM de solução-tampão de citrato de sódio , pH 6.0; ou com 50 mM solução-tampão de glicina-HCl (glicina: sc-29096), pH 3.5, com 0.01% (w/v) EDTA (EDTA: sc-29092). Aqueça à temperatura de 95° C por 5 minutos. Cubra totalmente com solução-tampão fresca por 5 minutos (o tempo de incubação ideal pode variar para cada tipo de tecido). Deixe os slides esfriarem por aproximadamente por 20 minutos. Lave com água deionizada três vezes por 2 minutos por lavagem. Aspire o excesso de líquido dos slides.
2. Pepsina: Incube a secções por 10–20 minutos em pepsina 0.1% em 0.01 N HCl em temperatura ambiente. Lave os slides várias vezes em água deionizada. Aspire o excesso de líquido dos slides.
3. Saponina: Incube as secções por 30 minutos em saponina 0.05% em água deionizada em temperatura ambiente. Lave pelo menos três vezes em PBS. Aspire o excesso de líquido dos slides.

D. Coloração para Imunofluorescência

• Use sucção para remover os agentes após cada passo, mas evite ressecar os espécimes entre os passos. Use reagente o suficiente par cobrir os espécimes (aproximadamente 100–500 µl por slide é uma quantidade adequada).
• Incube os espécimes em soro para bloqueamento normal a 10 % em PBS (Soluções-tampão e Soluções Gerais) por 20 minutos para inibir as ligações não específicas de IgG. Preferencialmente, o soro bloqueador ( Soro Normal para imunohistoquímica) deverá ser derivado da mesma espécie na qual o anticorpo secundário é produzido. Lave com PBS
• Incube com o anticorpo primário por 60 minutos. A concentração ideal do anticorpo devera ser determinada por titulação; recomenda-se a faixa de 0.5–5.0 µg/ml em PBS com soro normal bloqueador a 1.5%. Lave com três trocas de PBS por 5 minutos cada troca.
• Incube por 45 minutos com o anticorpo secundário conjugado à biotina ou conjugado a um fluorocromo (Anticorpos Secundários para Imunohistoquímica) diluídos a 1–5 µg/ml em PBS com soro normal bloqueador a 1.5%–3%. As concentrações ideias do anticorpo deverão ser determinadas por titulação. Lave com três trocas de PBS. Se for utilizado o anticorpo secundário conjugado a um fluorocromo, incube em um câmara escura e omita o próximo passo.
• Incube com estreptavidina-fluoresceína por 15 minutos em uma câmara escura. A concentração ideal do conjugado de estreptavidina para uma determinada aplicação deverá ser determinada por titulação; recomenda-se a faixa de 10–20 µg/ml em PBS. Lave extensivamente com PBS.
• Monte as lâminas com meio de montagem aquoso ou glicerol 90% em PBS.

OBSERVAÇÃO: Para a lista de meios para montagem para imunohistoquímica, incluindo-se o Organo/Limonene e Meio de Montagem UltraCruz^®, veja Meios de Montagem para imunohistoquímica.

• Examine as lâminas usando-se um microscópico para microscopia fluorescente com os filtros adequados. Guarde as lâminas em um local escuro em temperatura ambiente. (Meio de Montagem UltraCruz^®: sc-24941) ou à temperatura de 4° C (glicerol/PBS montagem).