Citometria de Fluxo

Prepare as células de acordo com o tipo celular

Prepare cells according to cell type.

Sangue

(Humano, Camundongo, Rato)

Para cada 1 ml de sangue, acrescente 14 ml de Solução para Lise Celular FCM em temperatura ambiente (sc-3621) para fazer a lise das células sanguíneas vermelhas. A lise celular não acontecerá corretamente se a solução estiver gelada/fria.
Incube por 5 minutos em temperatura ambiente em aparelho rotador. Não ultrapasse 5 minutos, pois as células brancas começarão a sofrer a lise celular depois de 5 minutos.
Centrifugue for 5 minutes à 1000 RPM para sangue humano, e à 2000 RPM para os sangues do rato e do camundongo.
Aspire o sobrenadante com cuidado e, então, ressuspenda o pellet em aproximadamente 50 ml 1X PBS gelado. Pegue uma pequena amostra para realizar a contagem das células.
Centrifugue for 5 minutes à 1000 RPM para sangue humano, e à 2000 RPM para os sangues do rato e do camundongo.
Aspire o sobrenadante.

Baço do Camundongo ou Outros Tecidos

Colete o órgão ou o tecido e prepare uma suspensão uniforme de células
Passe a suspensão através de uma peneira de células de 70 µM
Centrifugue por 5 minutes à 1000 RPM.
Despreze o sobrenadante e acrescente 5 ml de Solução para Lise Celular FCM (sc-3621) em temperatura ambiente.
Incube por 2–3 minutos em temperatura ambiente, permitindo que pedaços maiores caiam para o fundo do tubo.
Pipete cuidadosamente a suspensão e deposite em um novo tubo. Pegue uma pequena amostra e faça a contagem de células.
Centrifugue for 5 minutes à 1000 RPM.
Aspire o sobrenadante.

Suspensão de Linhagens Celulares

Pipete as células para fora da placa da cultura, lavando o prato para obter o maior número de células possível. Pegue uma pequena amostra e faça a contagem das células.
Centrifugue for 5 minutes à 1000 RPM.
Aspire o sobrenadante.

Monocamada/Linhagem Celular Aderente

Retire o meio por aspiração. Lave a placa de cultura uma vez com 1X PBS. Retire por aspiração o PBS.
Acrescente aproximadamente 5 ml de 0.2% EDTA (em PBS) para a placa de cultura. Usando uma solução de Tripsina/EDTA no lugar do EDTA a 0.2% poderá afetar a coloração da superfície celular.
Espere que as células se arredondem ("round up"). Colocar as células em uma incubadora pode agilizar esse processo. Verifique a placa a cada 5 minutos.
Acrescente aproximadamente 5 ml de meio para neutralizar o EDTA.
Pipete as células para fora da placa da cultura, lavando o prato para obter o maior número de células possível. Pegue uma pequena amostra e faça a contagem das células.
Centrifugue por 5 minutes à 1000 RPM.
Aspire o sobrenadante.

B. Estimulação Celular

Estimule as células como necessário

C. Preparação para a Coloração

Faça a fixação ou prepare as células vivas para a coloração

OBSERVAÇÃO: Se desejado, os receptores Fc poderão ser bloqueados para alguns tipos de células incluindo-se aqui, entre outras, células sanguíneas do rato e do camundongo, células do baço do camundongo, células da medula óssea do camundongo, e etc. O reagente bloqueador contém uma alta concentração de imunoglobulina que se liga aos receptores-Fc nas células. O reagente bloqueador deverá ser preferencialmente uma imunoglobulina da mesma espécie que a das células que estão sendo coradas. Recomenda-se a seguinte concentração de reagente bloqueador: 1 µg imunoglobulinas normais por 1 milhão de células.

Coloração do Fígado

Uma vez que o sobrenadante for aspirado da preparação de células, ressuspenda o pellet em quantidade suficiente de 1X PBS para obter a concentração final de 10 milhões de células/ml.
Faça o bloqueio através de incubação da suspensão de células com o reagente bloqueador por 10 minutos. Não lave. Prossiga com a coloração.

Fixação e Permeabilização de Células para Coloração Intracelular

Uma vez que o sobrenadante for aspirado da preparação de células, ressuspenda o pellet em quantidade suficiente de 1X PBS para obter a concentração final de 10 milhões de células/ml.
Faça o bloqueio através de incubação da suspensão de células com o reagente bloqueador por 10 minutos.
Ressuspenda o pellet em aproximadamente 50 ml de 1X PBS para lavar qualquer excesso do anticorpo bloqueador.
Centrifugue for 5 minutes à 1000 RPM.
Uma vez que o sobrenadante for aspirado da preparação de células, ressuspenda o pellet em solução-tampāo para fixação FCM (sc-3622). Use 1 mL por milhão de células.
Incube por 30 minutos em temperatura ambiente em um aparelho rotador.
Centrifugue por 5 minutos à 1500–2000 RPM. As células se tornam mais flutuantes após a fixação. Se o pellet for muito pequeno, centrifugue novamente em uma velocidade mais alta, mas não ultrapasse 3000 RPM.
Derrame o sobrenadante. Pode-se perder células através da aspiração a partir desse ponto, portanto, sempre decante o sobrenadante. Derrame com um único rápido movimento e não permita que o sobrenadante vá para frente e para trás sobre as células.
Ressuspenda o pellet em aproximadamente 50 ml de 1X PBS para lavar qualquer excesso de solução-tampāo para fixação.
Centrifugue por 5 minutos à 1500–2000 RPM.
Faça a decantação do sobrenadante. Nesse ponto, as células poderão ser ressuspendidas em uma pequena quantidade de PBS e estocadas por até um mês à temperatura de 4° C. Para permeabilizar nesse momento, prossiga para o próximo passo.

OBSERVAÇÃO: Você só devera prosseguir com a permeabilização se puder fazer a coloração imediatamente depois.

Se as células estiverem estocadas em PBS, centrifugue por 5 minutos à 1500–2000 RPM e decante o sobrenadante.
Quebre o pellet celular e em gota em gota acrescente a mesma quantidade de solução-tampão de Permeabilização FCM , sc-3623, GELADA (mantida à temperatura de -20° C) na proporção de 1 ml por 1 milhão de células. Vortex durante a adição.
Incube por 5 minutos somente em temperatura ambiente em um aparelho rotador.
Centrifugue, imediatamente, por 5 minutos à 2000–2500 RPM. As células se tornam mais flutuantes após a permeabilização, e devem ser tomados todos os cuidados para manter o volume de células.

OBSERVAÇÃO: Importante, se o pellet não for recuperado nesse passo, centrifugue novamente para tentar recuperar mais células.

Decante o sobrenadante e acrescente aproximadamente 50 ml de 1X PBS para lavar todo e qualquer excesso de solução-tampão de Permeabilização.
Centrifugue por 5 minutos à 2000–2500 RPM.
Decante o sobrenadante e ressuspenda o pellet em quantidade suficiente de Solução-tampão para lavagem FCM, sc-3624, para obter a concentração final de células de 10 milhões de células/ml. Nos passos de coloração, use a Solução-tampão para lavagem FCM em lugar do 1X PBS.

D. Coloração

Segui o protocolo para coloração direta e indireta

Coloração Direta

(Com Anticorpos conjugados a Fluorocromos)

Marque os tubos
Acrescente 1 µg do anticorpo conjugado a fluorocromo nos tubos
Acrescente 100 µl da suspensão de células preparadas (igual a 1 milhão de células) em cada tubo.
Vortex e incube por 15–30 minutos e um balde com gelo.
Retive o excesso do anticorpo marcador, acrescentando-se 1.5–2 ml de 1X PBS a cada tubo.
Centrifugue em microcentrífuga (tabletop) por 5 minutos à 2000 RPM. Essa velocidade poderá ser aumentada para a velocidade de 3000 ou 4000 RPM para coloração intracelular.
Aspire o sobrenadante, com cuidado para não desfazer o pellet.
Ressuspenda os pellets em 500 µl de 1% paraformaldeído. Os tubos poderão ser mantidos no escuro de 24 horas (máximo para coloração intracelular) a 1 semana (máximo para coloração de superfície celular).

Coloração Indireta

(Com anticorpos Primários não conjugados a Fluorocromo - e Anticorpos Secundários Conjugados a Fluorocromos)

Marque os tubos
Acrescente o anticorpo não conjugado a fluorocromo nos tubos. Use aproximadamente 1 µg por tubo.
Acrescente 100 µl da suspensão de células preparadas (igual a 1 milhão de células) em cada tubo.
Vortex e incube por 15–30 minutos e um balde com gelo.
Retive o excesso do anticorpo marcador, acrescentando-se 1.5–2 ml de 1X PBS a cada tubo.
Centrifugue em microcentrífuga (tabletop) por 5 minutos à 2000 RPM ( ou 3000 ou 4000 RPM para coloração intracelular).
Aspire o sobrenadante, com cuidado para não desfazer o pellet.
Acrescente 100 µl de 1X PBS a cada tubo. Acrescente o anticorpo secundário conjugado a fluorocromo aos tubos. Use 0.5–1 µg de anticorpo..
Vortex e incube por 15–30 minutos e um balde com gelo.
Retive o excesso do anticorpo marcador, acrescentando-se 1.5–2 ml de 1X PBS a cada tubo.
Centrifugue em microcentrífuga (tabletop) por 5 minutos à 2000 RPM ( ou 3000 ou 4000 RPM para coloração intracelular).
Aspire o sobrenadante, com cuidado para não desfazer o pellet.
Ressuspenda os pellets em 500 µl de 1% paraformaldeído. Os tubos poderão ser mantidos no escuro de 24 horas (máximo para coloração intracelular) a 1 semana (máximo para coloração de superfície celular).

E. Quantificação Celular

Faça a quantificação celular em 24 horas.