Trasfecção via Plasmídeo de Ativação CRISPR

Fase 1: Transfecção Transitória com Plasmídeo de Ativação CRISPR

Recomenda-se esse protocolo protocolo para um único poço de uma placa para cultura de 6 poços. Ajuste o número de células e reagentes proporcionalmente ao número de poços ou diferentes placas de cultura utilizados.

• Em uma placa para cultura de 6 poços, coloque 1.5 x10⁵ - 2.0 x10⁵ células em 3 ml de meio de cultura padrão para crescimento sem antibiótico por poço, 24 horas antes da transfecção. Cresça as células até a confluência de 40–80%. A quantidade de células iniciais semeadas no poço e o tempo para atingir a confluência ideal deverão ser determinados baseados na taxa de crescimento das células utilizadas na transfecçãoāo. São necessárias células saudáveis e subconfluentes para uma transfecção bem sucedida usando-se o Plasmídeo de Ativação.
• Prepare as seguintes soluções:

  OBSERVAÇÃO: A proporção ideal do Plasmídeo de DNA UltraCruz® para transfecção deverá ser determinada experimentalmente iniciando-se com 1 µg de plasmídeo e entre 5–15 µl do reagente de transfecção UltraCruz® . Uma vez que o volume do reagente de transfecção esteja otimizado para minimizar a toxicidade celular, as concentrações de plasmídeo poderão variar de 1–3 µg por poço. Se o volume ideal de reagente de transfecção UltraCruz® for 10 µl, então as concentrações do plasmídeo DNA de 1–3 µg/10 µl deverão ser testadas. Por exemplo, teste as quantidades do reagente de transfecção Plasmídeo DNA/UltraCruz®: 1 µg/10 µl, 2 µg/10 µl, e 3 µg/10 µl. A quantidade apropriada do complexo reagente de transfecção e Plasmídeo DNA/ UltraCruz® usada por poço deverá ser testada para determinar a quantidade que resulta nos maiores níveis de eficiência de transfecção.

  Solução A: Para cada transfecção, dilua 1–3 µg do plasmídeo DNA no meio de transfecção de plasmídeo: sc-108062  para obter um volume total de 150 µl. Pipete para cima e para baixo para misturar a solução. Deixe repousar por 5 minutos em temperatura ambiente.

  Solução B: Para cada transfecção, dilua 5–15 µl do reagente de transfecção UltraCruz®: sc-395739 com o meio de transfecção para plasmídeo DNA : sc-108062  o suficiente para obter um volume final de 150 µl. Pipete para cima e para baixo para misturar a solução. Deixe repousar por 5 minutos em temperatura ambiente.

  OBSERVAÇÃO: Não acrescente antibióticos ao meio de transfecção de plasmídeo : sc-108062.

• Acrescente a solução de plasmídeo DNA (Solução A) gota a gota diretamente na solução de reagente de transfecção UltraCruz® (Solução B) usando uma pipeta . Vortex imediatamente e incube no mínimo por 20 minutos em temperatura ambiente.
• Antes da transfecção, troque o meio com o meio de cultura fresco sem antibiótico. Acrescente a quantidade de 300 µl do complexo Plasmídeo DNA/UltraCruz® Reagente de Transfecção (Solução A + Solução B) gota a gota em cada poço.
• Agite a placa de cultura gentilmente para misturar.
• Incube as células por 24–72 horas sob as condições normais utilizadas para cultura das células utilizadas. Não é necessário trocar o meio durante nas primeiras 24 horas após a transfecção. Acrescente ou troque o meio caso necessário durante as 24–72 horas após a transfecção .
• Para as células transfectadas com o Plasmídeo de Ativação CRISPR, analise as células 48–72 horas após a transfecção.

FASE 2. Análise Celular

• Para análise de proteínas, troque o meio pelo meio de cultura padrão (sem o antibiótico para seleção) 3 dias antes da lise celular. Para fazer a lise celular de células aderentes, aspire o meio, lave as células com PBS, raspe as células e as centrifugue em baixa rotação para formar o pellet. Para células em suspensão, transfira a cultura para um tubo de microcentrífuga e centrifugue as células em baixa rotação para formar o pellet. Lave com PBS e centrifugue novamente. Para células HEK 293 ou HeLa em 100% de confluência acrescente 100 µl de solução-tampão do sistema RIPA para lise celular  sc-24948 ao pellet. Para demais linhagens celulares ou confluências, a quantidade de solução-tampão do sistema RIPA para lise celular RIPA usada deverá ser determinada experimentalmente. Faça a sonicação celular ou a ruptura celular. Incube o lisado em gelo por 10 minutos, vortex, e incube novamente por 10 minutos no gelo. Faça a sonicação celular ou a ruptura celular. Incube o lisado em gelo por 10 minutos, vortex, e incube novamente por 10 minutos no gelo. Use o Kit BCA Proteína Assay Kitpara determinar a concentração de proteína.
• Para análise via RT-PCR, isole RNA usando o método descrito por P. Chomczynski e N. Sacchi (1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156–159) ou usando um dos kits para isolamento de RNA disponíveis comercialmente.

Referencias:
PMID: 24157548, PMID: 23287718

Os reagentes de suporte para a ativação com plasmídeo CRISPR são ideais para obter com sucesso ativação do plasmídeo CRISPR da Santa Cruz Biotecnologia, Inc. em células mamíferas. As quantidades abaixo relacionadas referem-se ao uso de um placa para cultura de 6 poços.