Transdução de Partículas de Ativação Lentiviral
Recomenda-se esse protocolo para um único poço de uma placa para cultura de células de 6 poços. Ajuste as quantidades de células e reagentes proporcionalmente para o número de poços ou placa de diferentes tamanhos.
Dia 1
Em uma placa para cultura de células de 6 poços, cultive 1.5 x 105 - 2.5 x 105 células em 3 ml do meio de cultura padrão por poço, 24 horas antes da transfecçãoāo (o meio de cultura poderá conter soro e antibióticos). Cresça as células até 40–80% confluência. A quantidade de células iniciais e o percentual de confluência depois de 24 horas deverão ser determinados de acordo com a taxa de crescimento das células utilizadas para a transdução. É necessária a utilização de células saudáveis e subconfluentes para o sucesso da transdução com Partículas de Ativação.
Dia 2
Prepare a mistura com o meio completo e Polybrene® (sc-134220) na concentração final de 5 µg/ml. Remova o meio de cada poço e coloque3 ml do meio preparado com Polybrene® em cada poço (para placas para cultura de células de 6 poços).
OBSERVAÇÃO: Polybrene® é um policátion que neutraliza as interações de carga para aumentar as ligações proteicas entre o capsídeo pseudoviral e a membrana celular. A concentração ideal de Polybrene® depende do tipo de célula utilizado e poderá ser empiricamente determinada (em geral na faixa de 2-10 µg/ml). A exposição excessiva ao Polybrene® (>12 hr) poderá ser tóxica para alguns tipos de células.
Descongele as Partículas de Ativação Lentiviral em temperatura ambiente e misture gentilmente antes de usar. Infecte as células acrescentando as partículas de ativação lentiviral na cultura celular. Agite a placa gentilmente para espalhar as partículas e incube durante a noite. A quantidade de partículas virais usadas dependerá das características da linhagem celular a ser infectada.
OBSERVAÇÃO: Mantenhas as Partículas de Ativação Lentiviral descongeladas em gelo. Ciclos repetidos de congelamento e descongelamento e exposição prolongada das partículas em temperaturas ambientes poderão resultar em titulações virais menores.
OBSERVAÇÃO: Quando fizer a transdução de uma célula pela primeira vez, sugerimos utilizar várias quantidades de Partículas de Ativação Lentiviral a partir do estoque. Recomendamos, ainda, incluir um poço com células transduzidas com as Partículas de Ativação Lentiviral Controle (sc-4372822).
Dia 3
Remova o meio de cultura e coloque 3 ml do meio de cultura padrão (sem Polybrene®). Incube as células durante a noite.
Dia 4
Para selecionar os clones ativados, divida as células em 1:3 para 1:5, dependendo do tipo celular utilizado, e continue a incubação por 24–48 horas em meio completo. As células deverão manter o estágio de subconfluência durante todo o período de seleção por antibiótico descrito abaixo.
Dia 5 em diante
Selecione os clones ativados e estáveis via seleção com dicloridrato de puromicina (sc-108071), Higromicina B (sc-29067) e S HCl Blasticidina (sc-495389). Para seleção com antibiótico, use a quantidade suficiente para eliminar as células não tranduzidas. As concentrações de Puromicina variam entre 2–10 µg/ml, Higromicina B entre 200–500 µg/ml e S HCL Blasticidina entre 1–20 µg/ml são em geral suficientes, entretanto recomenda-se a titulação do antibiótico utilizado para cada tipo de linhagem celular ou células utilizadas. Troque o meio por meio seletivo contendo o antibiótico recém preparado a cada 3–4 dias, até que as colônias resistentes possam ser identificadas. Pegue várias colônias, expanda as mesmas e teste a ativação estável do gene alvo.
OBSERVAÇÃO: Os clones resultantes da seleção por antibiótico poderão ter diferentes níveis de ativação do gene alvo devido à integração aleatória no genoma celular do constructo de ativação,
OBSERVAÇÃO: Para análise de ativação genética via Western Blot, prepare os lisados celulares da seguinte maneira: Troque o meio pelo meio de cultura padrão (sem o antibiótico para seleção) 3 dias antes da lise celular. Para fazer a lise celular de células aderentes, aspire o meio, lave as células com PBS, raspe as células e as centrifugue em baixa rotação para formar o pellet. Para células em suspensão, transfira a cultura para um tubo de microcentrífuga e centrifugue as células em baixa rotação para formar o pellet. Lave com PBS e centrifugue novamente. Para células HEK 293 ou HeLa em 100% de confluência acrescente 100 µl de solução-tampão do sistema RIPA para lise celular sc-24948 ao pellet. Para demais linhagens celulares ou confluências, a quantidade de solução-tampão do sistema RIPA para lise celular RIPA usada deverá ser determinada experimentalmente. Faça a sonicação celular ou a ruptura celular. Incube o lisado em gelo por 10 minutos, vortex, e incube novamente por 10 minutos no gelo. Limpe o lisado por centrifugação em alta rotação por 20 minutos à temperatura de 4° C. Use o Kit BCA Protein Assay para determinar a concentração de proteína.
NOTE: OBSERVAÇÃO: Para análise de ativação genética via RT-PCR, isole RNA usando o método descrito por P. Chomczynski e N. Sacchi (1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156–159) ou usando um dos kits para isolamento de RNA disponíveis comercialmente.
BIOSSEGURANÇA
As Partículas de Ativação Lentiviral podem ser utilizadas em laboratórios com nível de biossegurança 2, em áreas padrão de cultura de células (e deverão ser tratadas com o mesmo grau de cuidado e segurança como qualquer outro agente potencialmente infeccioso). As Partículas de Ativação Lentiviral são incompetentes na replicação e foram criadas para se auto-inativarem após integradas no DNA genômico das células alvo.
Referências:
PMID: 25494202