Transdução de Partículas Lentivirais shRNA

Dia 1

• Coloque as células em uma placa para cultura de 12 poços 24 horas antes da infecção viral.
• Acrescente 1 ml do meio completo ideal de cultura (com sore e antibiótico) e incube as células durante a noite. As células deverão estar aproximadamente 50% confluentes no dia da infecção & (Dia 2).

OBSERVAÇÃO: Poderão também serem utilizadas outras placas para cultura para a transdução. Nesse caso, o número de células deverá ser ajustado de acordo com a área de cada poço ou placa para cultura.

Dia 2

• Prepare a mistura com o meio completo e Polybrene® (sc-134220) na concentração final de 5 µg/ml.
• Remova o meio dos poços e troque por 1 ml da mistura do meio de cultura com Polybrene® por poço (para um placa de 12 poços).

OBSERVAÇÃO: Polybrene® é um policátion que neutraliza as interações de carga para aumentar as ligações proteicas entre o capsídeo pseudoviral e a membrana celular. A concentração ideal de Polybrene® depende do tipo de célula utilizado e poderá ser empiricamente determinada (em geral na faixa de 2-10 µg/ml). A exposição excessiva ao Polybrene® (>12 hr) poderá ser tóxica para alguns tipos de células.

• Descongele as partículas de lentivirus em temperatura ambiente e agite gentilmente antes do uso.
• Infeccione as células acrescentado-se as partículas lentivirais shRNA na cultura de células
• Agite a placa gentilmente para espalhar as partículas e incube durante a noite. A quantidade de partículas virais usadas dependerá das características da linhagem celular a ser infectada.

OBSERVAÇÃO: Mantenhas as Partículas de Ativação Lentiviral descongeladas no gelo.  Ciclos repetidos de congelamento e descongelamento e a exposição prolongada das partículas em temperaturas ambientes poderão resultar em titulações virais menores.

OBSERVAÇÃO: Quando fizer a transdução de uma célula pela primeira vez com o constructo lentiviral shRNA, sugerimos utilizar várias quantidades de lentivirus shRNA a partir do estoque. Recomendamos, ainda, incluir um poço com células transduzidas com as Partículas Lentivirais shRNA Controle (sc-108080).

OBSERVAÇÃO: Use as Partículas Lentivirais copGFP Controle (sc-108084) para medir a eficiência da transdução.

Dia 3

• Remova o meio de cultura e coloque 1 ml do meio de cultura completo (sem Polybrene®).
• Incube as células durante a noite.

Dia 4

• Para selecionar os clones que expressam o shRNA, divida as células em 1:3 para 1:5, dependendo do tipo celular utilizado, e continue a incubação por 24–48 horas em meio completo.

Dias 5-6 e em diante

• Selecione os clones estáveis que expressem shRNA com dicloridrato de puromicina (sc-108071).
• Para a seleção com puromicina, use o suficiente para eliminar as células não tranduzidas. Em geral, as concentrações entre 2 a 10 µg/ml são o suficiente, entretanto, recomenda-se a titulação da puromicina quando utilizada em uma nova linhagem celular.
• Troque o meio por meio seletivo fresco contendo a puromicina a cada 3–4 dias, até que as colônias resistentes possam ser identificadas. Pegue várias colônias, expanda as mesmas e as teste para determinar a expressão estável de shRNA.

OBSERVAÇÃO: Os clones resistentes à puromicina poderão variar em relação à quantidade de expressão do shRNA, devido a forma aleatória pela qual os constructos de lentivirus são integrados no genoma da célula.

OBSERVAÇÃO: Para análise da expressão de shRNA via Western Blot, prepare o lisado celular da seguinte maneira:

• Lave as células um vez com PBS.
• Faça a lise celular em 100 µl da mistura de 1:1 de solução-tampão 2x para amostras para Eletroforese (sc-24945) e solução-tampão RIPA para lise celular (sc-24948) agitando-se gentilmente a placa de cultura de 12 poços ou pipetando-se para cima e para baixo.
• Faça a sonicação do lisado em gelo se necessário

OBSERVAÇÃO: Para análise da expressão de shRNA via RT-PCR, isole RNA usando o método descrito por P. Chomczynski e N. Sacchi (1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156–159) ou usando um dos kits para isolamento de RNA disponíveis comercialmente.

Biossegurança

As Partículas Lentivirais podem ser utilizadas em laboratórios com nível de biossegurança 2, em áreas padrão de cultura de células (e deverão ser tratadas com o mesmo grau de cuidado e segurança como qualquer outro agente potencialmente infeccioso). As Partículas Lentivirais são incompetentes na replicação e foram criadas para se auto-inativarem após a integração do shRNA no DNA genômico das células alvo.