Ensaios de Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP)

• Lave as células duas vezes com PBS em temperatura ambiente, ressuspenda em aproximadamente 5x10⁵ células/ml (aproximadamente 2x10⁷ células totais). Acrescente formaldeído a uma concentração final 1% e incube em temperatura ambiente por 10 minutos.
• Termine as reações de cross-linking acrescentando-se glicina a uma concentração final de 0.125 M.
• Faça o Pellet das células (2.000 RPM, 5 minutos) e lave as células uma vez com PBS resfriado em gelo.
• Ressuspenda as células em 6 ml de solução-tampão para lise celular (sc-45000) misturando-se gentilmente.
• Colete o extrato nuclear bruto por microcentrifugação á 2.000 RPM, por 5 minutos.
• Lave novamente com PBS. O pellet poderá ser congelado neste ponto, ou prossiga como se segue:
  1. Ressuspenda o pellet em ~1.9 ml solução-tampão básica para lise celular (sc-45001) e transfira para um tubo de 2 ml de microcentrífuga para o passo da sonicação.
  2. As condições de sonicação deverão ser otimizadas uma vez que os resultados podem variar quando se usam diferentes sonicadores. As seguintes condições foram estabelecidas usando-se um sonicador Sonics VC130 com uma sonda de 3 mm de ponta.
  3. Fazer a sonicação em gelo ajustando-se a saída de energia a 5–6, modo contínuo , 4 vezes com 30 segundos de intervalos.
  4. Centrifugue o extrato por 15 minutos, à 10.000 rpm à temperatura de 4° C e conserve o sobrenadante (cromatina).
  5. Determine a concentração de proteína do sobrenadante.
  6. Para o passo da imunoprecipitação (IP), recomenda-se a utilização de 100–500 µg de sobrenadante e 0.1-1 µl do reagente TransCruz (0.2–2 µg).

OBSERVAÇÃO: Os pesquisadores deverão considerar o uso do anticorpo primário conjugado à sefarose ou a partículas esféricas (beads) magnéticas como uma forma alternativa, em vez de usar os reagentes secundários de imunoprecipitação (ou seja, Proteína A-Agarose) como aqui descrito. A combinação dos anticorpos primários a diferentes epítopos de uma mesma proteína poder ser vantajosa em alguns casos.

• Limpe previamente a solução de cromatina acrescentado-se 50 µl de Proteína A/G PLUS-Agarose (sc-2003) e incube por 30 minutes à temperatura de 4° C. Centrifugue em velocidade máxima por 5 minutos à temperatura de 4° C.
• Acrescente o anticorpo primário ao sobrenadante e incube durante a noite à temperatura de 4° C.
• Acrescente 50 µl de Proteína A/G PLUS-Agarose (sc-2003) e incube por 2 horas à temperatura de 4° C.
• Colha as partículas esféricas (beads) por centrifugação à 12.000 rpm por 20 segundos e coloque o tubo no gelo.
• Lave as partículas esféricas (beads) duas vezes com 1 ml de solução-tampão salina para lise (sc-45001).
• Lave o pellet quatro vezes com solução-tampão (sc-45002).
• Ressuspenda as partículas esféricas (beads) em 400 µl de solução-tampão de eluição (sc-45003).
• Reverta os cross-links incubando-se o tubo em banho-maria à temperatura de 67° C , misturando-se ocasionalmente durante duas horas. Remova as beads por centrifugação e continue com a incubação do sobrenadante à temperatura de 67° C durante a noite.
• Centrifugue por 3 minutos à 10.000 rpm para remover todos e quaisquer resíduos das beads e conserve o sobrenadante. /li>
• Para isolar o DNA, extraia o sobrenadante 500 µl fenol/clorofórmio/ álcool isoamil (25:24:1), vortex totalmente e separe as fases por centrifugação por 3 minutos à 14.000 rpm.
• Conserve a fase aquosa, extraia a fase orgânica uma vez com 100 µl 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.1 (TE) e misture as fases aquosas.
• Extraia a mistura das fases aquosas com 600 µl de clorofórmio/álcool isoamil.
• O DNA poderá ser concentrado usando-se kits disponíveis comercialmente.