Inibição da Expressão Genética Mediada por SiRNA
- Em uma placa para cultura celular de seis poços, coloque 2 x 105 células por poço em 2 ml de meio normal para crescimento sem antibiótico e suplementado FBS.
OBSERVAÇÃO: Recomenda-se esse protocolo para um único poço de uma placa para cultura celular de seis poços. Ajuste as quantidades de células e reagentes proporcionalmente ao número de poços ou placas para cultura celular de diferentes tamanhos.
- Incube as células à temperatura de 37° C em uma incubadora de CO2 até que as células atinjam a confluência de 60–80%, o que leva em geral 18-24 horas.
OBSERVACAO: São necessárias células saudáveis e subconfluentes para o sucesso dos experimentos de transfecção. Recomenda-se verificar a viabilidade celular um dia antes da transfecção.
- Prepare as seguintes soluções:
Solução A: Para cada transfecção, dilua 2–8 µl do siRNA duplex (i.e., 0.25–1 µg ou 20–80 pmols siRNA) em 100 µl de Meio de Transfecção para siRNA: sc-36868.
Solução B: Para cada transfecção, dilua 2–8 µl de Reagente para Transfecção de siRNA : sc-29528 em 100 µl Meio para Transfecção de siRNA : sc-36868. O Pico de atividade deverá ser por volta de 6 µl do Reagente para Transfecção de siRNA.
OBSERVAÇÃO: Não acrescentar soro ou antibióticos ao Meio para Transfecção de siRNA:sc-36868
OBSERVAÇÃO: A quantidade ideal de siRNA usada na Transfecção pode variar para cada proteína alvo e, portanto, deverá ser determinada experimentalmente.
OBSERVAÇÃO: Se uma concentração de siRNA mais baixa for usada, dilua o siRNA adequadamente com solução-tampão para diluição de siRNA : sc-29527.
OBSERVAÇÃO: Apesar de altamente eficaz para uma grande variedade de linhagens celulares, o Reagente de Transfecção: sc-29528 pode não ser compatível para o uso em todas as linhagens celulares.
- Acrescente a solução de siRNA duplex (Solução A) diretamente para diluir o Reagente de Transfecção (Solução B) usando-se um pipeta. Misture gentilmente pipetando-se para cima e para baixo a mistura das soluções e incube a mistura por 15–45 minutos em temperatura ambiente.
- Lave as células uma vez com 2 ml com o meio para Transfecção de siRNA: sc-36868. Aspire o meio e prossiga imediatamente para o próximo passo.
- Para cada transfecção, acrescente 0.8 ml do meio para Transfecção de siRNA a cada tubo contendo a mistura de Reagentes para Transfecção (Solução A + Solução B). Misture gentilmente e cubra as células, previamente lavadas, com a mistura.
- Incube as células por 5-7 horas à temperatura de 37° C em uma incubadora de CO2.
OBSERVAÇÃO: Períodos mais longos de transfecção poderão ser necessários dependendo-se das linhagens celulares. Entretanto, períodos prolongados de inanição celular podem resultar em morte e destacamento celular.
OBSERVAÇÃO: O siRNA Controle Conjugado a Fluoresceína deverá ser incubado somente por um total de 5–7 horas à temperatura de 37° C em uma incubadora de CO2. Ao final da incubação, o siRNA controle estará pronto para ser testado por microscopia fluorescente.
- Acrescente 1 ml de meio normal para crescimento contendo 2 vezes a quantidade de normal de soro e 2 vezes a concentração de antibióticos (2x meio normal de crescimento) sem remover a mistura de transfecção. Se a toxicidade for um problema, remova a mistura de transfecção e troque por meio normal para crescimento
- Incube as células por um período adicional de 18–24 horas.
- Aspire o meio e troque por meio fresco normal de crescimento 1x.
- Teste as células usando o protocolo adequado 24–72 horas após a adição de meio fresco descrita no passo acima.
OBSERVAÇÃO: Os devidos controles deverão sempre ser incluídos nos experimentos de siRNA. Use os controles a seguir siRNAs: sc-37007, sc-44230, sc-44231, sc-44232, sc-44233, sc-44234, sc-44235, sc-44236, sc-44237 ou sc-44238 ou ainda, os controles siRNA Controle (Conjugados à Fluoresceína): sc-36869, sc-44239, sc-44240 ou sc-44241. Cada controle contém uma sequência embaralhada (scrambled sequence) que não leva a qualquer degradação específica de nenhum mRNA celular conhecido.
OBSERVAÇÃO: Para análise via Western blot prepare o lisado celular da seguinte maneira: Lave as células uma vez com PBS. Faça a lise celular em 300 µl de Solução-tampão 1X para amostras em Eletroforese (sc-24945 Solução-tampão 2X para amostras em Eletroforese) agitando-se gentilmente a placa de 6 poços, ou ainda, pipetando-se para cima e para baixo. Faça a sonicação do lisado em gelo caso necessário.
OBSERVAÇÃO: Para análise via RT-PCR, isole RNA usando o método descrito por P. Chomczynski e N. Sacchi (1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156–159) ou usando um dos kits para isolamento de RNA disponíveis comercialmente.