Tyrosinase Plásmido CRISPR/Cas9 KO (m2): sc-423566-KO-2

Descripción general

Tyr codifica la tirosinasa, una oxidasa dependiente de cobre que cataliza los pasos limitantes de la velocidad en la biosíntesis de melanina al convertir la L-tirosina en L-DOPA y DOPAquinona en los melanosomas. La actividad de la tirosinasa favorece la diferenciación de los melanocitos y la maduración de los gránulos de pigmento mediante la regulación de complejos enzimáticos melanogénicos y de programas de acidificación y tráfico de orgánulos. La alteración de Tyr perjudica la producción de eumelanina y feomelanina, modificando la respuesta a la radiación UV, el manejo del estrés oxidativo y la señalización dependiente del pigmento en la piel, los folículos pilosos y los tejidos oculares. En genética del ratón, Tyr es un locus canónico de pigmentación que se utiliza con frecuencia para estudiar la melanogénesis, la biología del melanosoma y fenotipos asociados a la pigmentación relevantes para el albinismo y los defectos pigmentarios.

El plásmido CRISPR/Cas9 KO Tyrosinase (m2) es un conjunto de plásmidos diseñado para la interrupción selectiva del gen Tyr en líneas celulares mouse. Cada plásmido del conjunto coexpresa un ARN guía específico (sgRNA) único, dirigido a un sitio distinto dentro del locus Tyr, junto con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes, y codifica GFP para permitir la identificación fluorescente y el enriquecimiento de las células transfectadas con éxito. Esta estrategia multiguía aumenta la probabilidad de inducir desplazamientos de marco de lectura o deleciones que produzcan una inactivación funcional, ofreciendo una alternativa más robusta a los enfoques de guía única. Las DSB inducidas en múltiples sitios se resuelven mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o, cuando se utiliza con la plantilla donante HDR incluida, mediante reparación dirigida por homología (HDR) en un sitio diana definido dentro del locus.

Cuando se utiliza junto con el donante HDR que expresa RFP, la fluorescencia de GFP y RFP puede utilizarse conjuntamente para distinguir las poblaciones de células transfectadas de las editadas, lo que agiliza los flujos de trabajo de clasificación y selección de clones basados en citometría de flujo.

Donante de reparación dirigida por homología (HDR) — Casete de puromicina con reportero RFP

Para aplicaciones que requieren clones knockout confirmados y seleccionables, el plásmido HDR Tyrosinase (m2) incluye un constructo donante HDR que contiene un casete de resistencia a la puromicina (PuroR) y un reportero de proteína fluorescente roja (RFP), flanqueado por brazos de homología específicos de un sitio diana definido Tyr.
Cuando se cotransfecciona con el plásmido Tyrosinase CRISPR/Cas9 KO (m2):

• El casete PuroR-RFP se integra en el sitio de corte de Cas9 mediante HDR, interrumpiendo el marco de lectura abierto Tyr.
  La fluorescencia de la RFP proporciona un indicador visual inmediato del éxito de la integración, lo que permite la identificación o clasificación basada en la fluorescencia de las células editadas antes o junto con la selección con puromicina.
  Las células editadas con éxito se confirman mediante la resistencia a la puromicina, lo que reduce sustancialmente la carga de cribado de clones.
  Esta estrategia de selección es ideal para generar líneas celulares KO clonales estables para estudios funcionales posteriores, cribado de fármacos o desarrollo de modelos.

Sistema de eliminación del casete Cre-lox

La construcción donante HDR cuenta con sitios loxP que flanquean el casete de selección PuroR-RFP para permitir la eliminación limpia del marcador tras la confirmación del clon. La expresión transitoria de la recombinasa Cre a través del vector Cre: sc-418923 incluido extirpa el casete, dejando un sitio loxP residual mínimo dentro del locus Tyr y eliminando posibles efectos de confusión en los ensayos posteriores.
Este enfoque en dos pasos:

• Minimiza la alteración de la arquitectura local de la cromatina y de los elementos reguladores vecinos
  Restaura un contexto genómico casi nativo en el locus editado
  Permite reutilizar la estrategia de selección con puromicina en la misma línea celular para ediciones adicionales

Características principales

• gRNA dirigido a los exones Tyr críticos para la función Tyrosinase
  Coexpresión de SpCas9 y sgRNA a partir de un único plásmido para una administración simplificada
  Donante HDR con resistencia a la puromicina para la selección positiva de clones
  Casete PuroR flanqueado por loxP con vector de recombinasa Cre para la eliminación sin fisuras del marcador
  Se suministra listo para su uso mediante transfección

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.