MSK2 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h): sc-404150
- Zielspezies: human
- 20 µg transfektionsfertige, aufgereinigte Plasmid DNA; geeignet für 20 Transfektionen
- MSK2 Das CRISPR/Cas9-Knockout (KO)-Plasmid (h) ist ein Pool von Plasmiden, von denen jedes für die Cas9-Nuklease und eine zielspezifische 20-nt-Guide-RNA (gRNA) kodiert, die für maximale Knockout-Effizienz unter Verwendung von Sequenzen aus der GeCKO v2-Bibliothek entwickelt wurde
- gRNA-Sequenzen lenken Cas9 so, dass es ortsspezifische Doppelstrangbrüche (DSBs) im MSK2-Genomlokus induziert, was zu einem Gen-Knockout durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) führt
- MSK2 HDR-Plasmid (h) (sc-404150-HDR) wird für die Co-Transfektion mit dem MSK2 CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (h) empfohlen, um die Selektion erfolgreich editierter Zellen durch HDR-vermittelte Integration einer Puromycin-Resistenzkassette und eines RFP-Reportergens zu ermöglichen
- Das MSK2 HDR-Plasmid (h) ist ein Pool von Plasmiden, von denen jedes eine HDR-Matrize (Homology-Directed Repair) enthält, die den gRNA-Zielstellen im MSK2 CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (h) entspricht
- Jedes HDR-Plasmid enthält zwei ~800 bp lange Homologiearme, die die Puromycin-Resistenz- und RFP-Kassetten flankieren und so konzipiert sind, dass sie an genomische DNA-Sequenzen binden, die die durch Cas9 induzierte Doppelstrangbruchstelle umgeben, und eine präzise HDR-vermittelte Integration ermöglichen
- Die Puromycin-Resistenz- und RFP-Gene werden von LoxP-Stellen flankiert, was die Entfernung der Selektionsmarker mittels Cre-Rekombinase (Cre-Vektor: sc-418923) nach der Etablierung stabiler Knockout-Zelllinien ermöglicht
- Nach der Transfektion kann die Effizienz des Gen-Knockouts per Western Blot oder histologisch mit folgendem Antikörper überprüft werden: MSK2: sc-377151
Bestellinformation
| Produkt | Katalog # | EINHEIT | Preis | ANZAHL | Favoriten | |
MSK2 CRISPR/Cas9 KO Plasmid (h) | sc-404150 | 20 µg | $397.00 | |||
MSK2 HDR Plasmid (h) | sc-404150-HDR | 20 µg | $445.00 |
Übersicht
RPS6KA4 kodiert die mitogen- und stressaktivierte Kinase 2 (MSK2), eine nukleäre Serin/Threonin-Kinase, die nachgeschaltet von der ERK1/2- und p38-MAPK-Signalübertragung aktiviert wird. MSK2 phosphoryliert transkriptionelle Regulatoren wie CREB/ATF1 sowie Histon H3 und verknüpft damit extrazelluläre Signale mit Chromatin-Remodelling und stimulusabhängigen Genexpressionsprogrammen. Über diese Funktionen trägt MSK2 zur Regulation inflammatorischer Transkription, zur Induktion von Immediate-Early-Genen und zu zellulären Antworten auf Stress und Wachstumsfaktoren bei. Eine fehlregulierte MAPK–MSK-Signalübertragung wurde mit veränderter transkriptioneller Kontrolle in der Krebsbiologie, bei neuroinflammatorischen Prozessen und anderen Pathologien in Verbindung gebracht, die durch aberrante Stressantwort-Signale gekennzeichnet sind.
MSK2 CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (h) ist ein Pool von Plasmiden, die für die gezielte Disruption des RPS6KA4-Gens in human-Zelllinien entwickelt wurden. Jedes Plasmid im Pool koexprimiert eine einzigartige sgRNA, die auf eine bestimmte Stelle innerhalb des RPS6KA4-Lokus abzielt, zusammen mit der Streptococcus pyogenes Cas9-Nuklease, und kodiert für GFP, um die fluoreszente Identifizierung und Anreicherung erfolgreich transfizierter Zellen zu ermöglichen. Diese Multi-Guide-Strategie erhöht die Wahrscheinlichkeit, Frameshifts oder Deletionen zu induzieren, die zu einem funktionellen Knockout führen, und bietet damit eine robustere Alternative zu Single-Guide-Ansätzen. An mehreren Stellen induzierte DSBs werden durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder, bei Verwendung mit der enthaltenen HDR-Donor-Matrize, durch homologe Reparatur (HDR) an einer definierten Zielstelle innerhalb des Lokus repariert.
Bei Verwendung in Verbindung mit dem RFP-exprimierenden HDR-Donor können GFP- und RFP-Fluoreszenz gemeinsam genutzt werden, um transfizierte von editierten Zellpopulationen zu unterscheiden, was die auf Durchflusszytometrie basierenden Sortier- und Klonauswahl-Workflows optimiert.
Homology-Directed Repair (HDR)-Donor — Puromycin-Kassette mit RFP-Reporter
Für Anwendungen, die bestätigte, selektierbare Knockout-Klone erfordern, enthält das MSK2 HDR-Plasmid (h) ein HDR-Donorkonstrukt mit einer Puromycin-Resistenzkassette (PuroR) und einem Reporter für rotes fluoreszierendes Protein (RFP), flankiert von Homologiearmen, die für eine definierte RPS6KA4 Zielstelle spezifisch sind.
Bei Co-Transfektion mit dem MSK2 CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (h):
- Die PuroR-RFP-Kassette integriert sich über HDR an der Cas9-Schnittstelle und unterbricht dabei das RPS6KA4 offene Lesegerüst.
Die RFP-Fluoreszenz liefert einen unmittelbaren visuellen Hinweis auf eine erfolgreiche Integration und ermöglicht die fluoreszenzbasierte Identifizierung oder Sortierung editierter Zellen vor oder parallel zur Puromycin-Selektion.
Erfolgreich editierte Zellen werden durch Puromycin-Resistenz bestätigt, was den Aufwand für das Klon-Screening erheblich reduziert.
Diese Selektionsstrategie eignet sich ideal zur Erzeugung stabiler, klonaler KO-Zelllinien für nachgelagerte Funktionsstudien, Wirkstoffscreenings oder die Modellentwicklung.
Cre-lox-Kassetten-Entfernungssystem
Das HDR-Donorkonstrukt verfügt über loxP-Stellen, die die PuroR-RFP-Selektionskassette flankieren, um eine saubere Markerentfernung nach der Klonbestätigung zu ermöglichen. Die transiente Expression der Cre-Rekombinase über das enthaltene Cre-Vektor: sc-418923 schneidet die Kassette heraus, wobei eine minimale Rest-loxP-Stelle innerhalb des RPS6KA4-Lokus verbleibt und potenzielle Störeffekte auf nachgeschaltete Assays eliminiert werden.
Dieser zweistufige Ansatz:
- Minimiert Störungen der lokalen Chromatinarchitektur und benachbarter regulatorischer Elemente
Stellt einen nahezu nativen genomischen Kontext am editierten Locus wieder her
Ermöglicht die Wiederverwendung der Puromycin-Selektionsstrategie in derselben Zelllinie für weitere Editierungen
Hauptmerkmale
- gRNA, die auf RPS6KA4 Exon(e) abzielt, die für die MSK2 Funktion entscheidend sind
Koexpression von SpCas9 und sgRNA aus einem einzigen Plasmid für eine vereinfachte Verabreichung
HDR-Donor mit Puromycin-Resistenz für die positive Klonselektion
loxP-flankierte PuroR-Kassette mit Cre-Rekombinase-Vektor für die nahtlose Markerentfernung
Wird gebrauchsfertig für die Verabreichung durch Transfektion geliefert
Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.