myocilin Plásmido CRISPR/Cas9 KO (h): sc-401843

Descripción general

MYOC codifica la miocilina, una glucoproteína secretada enriquecida en la malla trabecular y otros tejidos oculares, que se asocia con la matriz extracelular y modula la adhesión célula–matriz y la organización del citoesqueleto. La miocilina se procesa a través del retículo endoplásmico y la vía secretora, y su plegamiento/manejo implica mecanismos de control de calidad proteica que se entrecruzan con el estrés del RE y las redes de proteostasis. La alteración de la expresión de miocilina o su mal plegamiento puede perturbar la homeostasis de la matriz extracelular y la mecánica celular, influyendo en la fisiología del drenaje del humor acuoso. MYOC se estudia ampliamente en el contexto de fenotipos asociados al glaucoma y de la biología celular ocular, con relevancia adicional para la secreción, la remodelación de la MEC y la señalización de respuesta al estrés.

El plásmido CRISPR/Cas9 KO myocilin (h) es un conjunto de plásmidos diseñado para la interrupción selectiva del gen MYOC en líneas celulares human. Cada plásmido del conjunto coexpresa un ARN guía específico (sgRNA) único, dirigido a un sitio distinto dentro del locus MYOC, junto con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes, y codifica GFP para permitir la identificación fluorescente y el enriquecimiento de las células transfectadas con éxito. Esta estrategia multiguía aumenta la probabilidad de inducir desplazamientos de marco de lectura o deleciones que produzcan una inactivación funcional, ofreciendo una alternativa más robusta a los enfoques de guía única. Las DSB inducidas en múltiples sitios se resuelven mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o, cuando se utiliza con la plantilla donante HDR incluida, mediante reparación dirigida por homología (HDR) en un sitio diana definido dentro del locus.

Cuando se utiliza junto con el donante HDR que expresa RFP, la fluorescencia de GFP y RFP puede utilizarse conjuntamente para distinguir las poblaciones de células transfectadas de las editadas, lo que agiliza los flujos de trabajo de clasificación y selección de clones basados en citometría de flujo.

Donante de reparación dirigida por homología (HDR) — Casete de puromicina con reportero RFP

Para aplicaciones que requieren clones knockout confirmados y seleccionables, el plásmido HDR myocilin (h) incluye un constructo donante HDR que contiene un casete de resistencia a la puromicina (PuroR) y un reportero de proteína fluorescente roja (RFP), flanqueado por brazos de homología específicos de un sitio diana definido MYOC.
Cuando se cotransfecciona con el plásmido myocilin CRISPR/Cas9 KO (h):

• El casete PuroR-RFP se integra en el sitio de corte de Cas9 mediante HDR, interrumpiendo el marco de lectura abierto MYOC.
  La fluorescencia de la RFP proporciona un indicador visual inmediato del éxito de la integración, lo que permite la identificación o clasificación basada en la fluorescencia de las células editadas antes o junto con la selección con puromicina.
  Las células editadas con éxito se confirman mediante la resistencia a la puromicina, lo que reduce sustancialmente la carga de cribado de clones.
  Esta estrategia de selección es ideal para generar líneas celulares KO clonales estables para estudios funcionales posteriores, cribado de fármacos o desarrollo de modelos.

Sistema de eliminación del casete Cre-lox

La construcción donante HDR cuenta con sitios loxP que flanquean el casete de selección PuroR-RFP para permitir la eliminación limpia del marcador tras la confirmación del clon. La expresión transitoria de la recombinasa Cre a través del vector Cre: sc-418923 incluido extirpa el casete, dejando un sitio loxP residual mínimo dentro del locus MYOC y eliminando posibles efectos de confusión en los ensayos posteriores.
Este enfoque en dos pasos:

• Minimiza la alteración de la arquitectura local de la cromatina y de los elementos reguladores vecinos
  Restaura un contexto genómico casi nativo en el locus editado
  Permite reutilizar la estrategia de selección con puromicina en la misma línea celular para ediciones adicionales

Características principales

• gRNA dirigido a los exones MYOC críticos para la función myocilin
  Coexpresión de SpCas9 y sgRNA a partir de un único plásmido para una administración simplificada
  Donante HDR con resistencia a la puromicina para la selección positiva de clones
  Casete PuroR flanqueado por loxP con vector de recombinasa Cre para la eliminación sin fisuras del marcador
  Se suministra listo para su uso mediante transfección

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.