Coloração com Imunoperoxidases

A. Cultura de Células de Tecidos

• Cresça as células em cultura em uma lâmina de vidro estéril (lâminas com cobertura e Micro-slides para imunohistoquímica) durante a noite à temperatura de 37° C. Lave rapidamente com PBS (Soluções-tampão e Soluções Gerais) e faça a fixação das células usando um dos seguintes métodos:
  1. 5 minutos em metanol resfriado à temperatura de -10° C, deixar secar ao ar (método recomendado); ou
  2. 2 minutos acetona gelada, deixar secar ao ar; ou
  3. 10 minutos em 1% formalina em PBS (manter molhado).
• Lave em 3 trocas de PBS.

Opcional: Incube por 5–7 minutes in 0.1–1% peroxido de hidrogênio em PBS para extinguir a atividade das peroxidases endógenas. Lave em PBS duas vezes por 5–7 minutes cada lavagem.

Secções de Tecidos Congelados

• Congele o tecido em bloco em nitrogênio líquido de acordo com os procedimentos normais. O bloco poderá ser estocado à temperatura de -70° C por até duas semanas antes do seccionamento.
• Limpe os slides de vidro com 95% de etanol, e trate com solução para subbing e deixar secar ao ar. Ou use slides pré-tratados.
• Corte secções de 4- a 10-micron de espessura. Faça a adesão das secções aos slides em temperatura ambiente. Os slides poderão ser estocados à temperatura de -70° C. Descongele os slides em temperatura ambiente antes de fixar e corar.

OBSERVAÇÃO: Para obter a lista dos meios de montagem em imunohistoquímica incluindo Organo/Limonene e UltraCruz™ Mounting, veja em Meios de Montagem para Imunohistoquímica.

• Faça a fixação dos slides em acetona gelada por 10 minutos e mantenha as mesmas refrigeradas (ou escolha outro método de fixação). Lave em 3 trocas de PBS (Soluções-tampão e Soluções Gerais).

Opcional: Incube por 5–7 minutos em 0.1–1% de peroxido de hidrogênio em PBS para extinguir a atividade das peroxidases endógenas. Lave em PBS duas vezes por 5–7 minutos cada lavagem.

OBSERVAÇÃO: Para tecidos que contenham um alto nível de biotina endógena (o que pode resultar em alto níveis de manchas no fundo, contrastes, ou ainda "background staining"), recomenda-se a utilização do protocolo de fixação em formalina, protocolo para secções de tecidos embebidos em parafina, uma vez que a biotina endógena é geralmente destruída em tecidos embebidos em parafina.

C. Secções de Tecidos Fixados em Formalina, e Embebidos em Parafina.

• Fixe as secções de tecidos em formalina e prossiga com os procedimentos para formar os blocos embebidos em parafina de acordo com os protocolos padrões.
• Limpe os slides de vidro com 95% de etanol, e trate com solução para subbing e deixe secar ao ar. Ou use slides pré-tratados.
• Corte o tecido em secções de 4–6 mícron de espessura, e coloque-as nos slides . Retire a parafina em xilenos usando três trocas de 5 minutos para cada troca. Reidrate as secções gradualmente através de álcoois em diferentes concentrações: lave em etanol 100% duas vezes por 15 minutos cada lavagem, seguido de duas lavagens em etanol 90% por 15 minutos cada lavagem. Lave em H2O deionizada por 1 minuto sob agitação. Aspire o excesso de líquido dos slides.

Opcional: a exposição do antígeno poderá ser realizada neste momento. Alguns determinantes antigênicos são escondidos pela fixação em formalina e pelos procedimentos de embedamento em parafina e poderão ser expostos por um dos métodos descritos abaixo.

1. Tratamento por Calor (método recomendado): Coloque os slides em um vasilhame e cubra com 10 mM de solução-tampão de citrato de sódio , pH 6.0; ou com 50 mM solução-tampão de glicina-HCl (glicina: sc-29096), pH 3.5, com 0.01% (w/v) EDTA (EDTA: sc-29092). Aqueça à temperatura de 95° C por 5 minutos. Cubra totalmente com solução-tampão fresca por 5 minutos (o tempo de incubação ideal pode variar para cada tipo de tecido). Deixe os slides esfriarem por aproximadamente por 20 minutos. Lave com água deionizada três vezes por 2 minutos por lavagem. Aspire o excesso de líquido dos slides.
2. Pepsina: Incube a secções por 10–20 minutos em pepsina 0.1% em 0.01 N HCl em temperatura ambiente. Lave os slides várias vezes em água deionizada. Aspire o excesso de líquido dos slides.
3. Saponina: Incube as secções por 30 minutos em saponina 0.05% em água deionizada em temperatura ambiente. Lave pelo menos três vezes em PBS. Aspire o excesso de líquido dos slides.

Opcional: Incube por 5–7 minutes peroxido de hidrogênio 0.1–1% em água deionizada para extinguir a atividade das peroxidases endógenas. Lave em PBS duas vezes por for 5–7 minutos cada lavagem.

D. Coloração Indireta com Imunoperoxidases

• For coloração indireta com imunoperoxidase de secções de tecidos, recomenda-se o uso de ABC ImmunoCruz™ da Santa Cruz Biotecnologia, ou Sistema de Coloração LSAB . O sistema de coloração ImmunoCruz™ ABC utiliza o complexo de peroxidase pré-formado de avidina-biotinalada de rábano como agente de detecção, enquanto o o sistema de coloração ImmunoCruz™ LSAB utiliza o complexo Avidina D-HRP. Nos sistemas de coloração ImmunoCruz™ incluem-se todos os reagentes secundários pré-diluidos e prontos para o uso. Os protocolos de pesquisa encontram-se disponíveis em todos os sistemas de coloração; e ainda encontram-se disponíveis abaixo os protocolos abreviados desses sistemas de coloração
• Todas as etapas e procedimentos deverão ser realizadas em temperatura ambiente em uma câmera umidificadora. Permita que todos os reagentes dos sistemas de coloração atinjam a temperatura ambiente antes da utilização dos mesmos. As secções de tecidos não deverão ser ressecadas em nenhum momento. Use sucção para remover os agentes, mas não permita que os espécimes se ressequem entre cada passo. Use os reagentes o suficiente para cobrir todo o espécime (em geral, aproximadamente 100 µl por slide é o suficiente). Use os procedimentos de lavagem sugeridos para assegurar que não haja interferência de reagentes a cada etapa.

Sistemas de Coloração ImmunoCruz_TM ABC /h2>

• Incube os espécimes por 1 hora em soro norma para bloqueamento a 5% em PBS (Soluções-tampão e Soluções Gerais). Preferencialmente, o soro bloqueador ( Soro Normal para imunohistoquímica) deverá ser derivado da mesma espécie na qual o anticorpo secundário é produzido. Remova o soro bloqueador dos slides.
• Incube o anticorpo primário por 30 minutos em temperatura ambiente ou durante a noite à temperatura de 4° C. A concentração ideal do anticorpo devera ser determinada por titulação; recomenda-se 0.5–5.0 µg/ml de anticorpo diluído em PBS com o soro normal de bloqueamento a 5%. Lave com três trocas de PBS durante 5–7 cada lavagem.
• Incube por 45 minutos com anticorpo secundário conjugado à biotina fornecido, ou em aproximadamente 1 µg/ml diluído em PBS com o soro normal de bloqueamento a 1.5% . Lave com três trocas de PBS durante 5–7 cada lavagem.
• Incube por 30 minutos com o reagente enzimático de avidina biotina. Lave com três trocas de PBS durante 5–7 cada lavagem.
• Incube em substrato de peroxidase fornecido por 1–5 minutos, ou até que a coloração desejada seja revelada. Os slides individuas deverão ser monitorados para determinar o tempo de revelação da coloração. Lave as secções em água deionizada por 5 minutos. Se desejado, faca a contra-coloração em formulação de Gill #2 hematoxilina (sc-24973) por 1–10 segundos. Lave imediatamente com várias trocas de água deionizada.
• Desidrate através de álcoois e xilenos da seguinte maneira: Mergulhe a secção em etanol 90% duas vezes por 3 minutos cada vez, em seguida etanol 100% duas vezes por 3 minutos cada vez, em seguida, xilenos por três vezes por 10 segundos cada vez. Remova o excesso de xileno com papel absorvente. Imediatamente acrescente 1-2 gotas de meio para montagem permanente (ou seja, Clarion sc-24942), cubra os slides com a lâmina de cobertura apropriada (sc-24975) e observe sob a luz de microscópio.

Sistemas de Coloração ImmunoCruz^TM LSAB

• Incube os espécimes por 20 minutos em 1–3 gotas do soro bloqueador. Aspire o soro dos slides.
• Dilua o anticorpo primário em soro bloqueador a 0.5–5.0 µg/ml como determinado pela titulação do anticorpo. Incube por 2 horas. Lave com PBS (Soluções-tampão e Soluções Gerais) e lave em PBS duas vezes por 2 minutos cada lavagem em um placa agitadora. Aspire o excesso de líquido dos slides.
• Incube por 30 minutos em 1–3 gotas do anticorpo secundário biotinilado. Lave como descrito acima.
• Incube por 30 minutos em 1–3 gotas do complexo Avidina D-HRP. Lave como descrito acima.
• Acrescente 1–3 gotas da mistura do substrato HRP. Revele por 30 segundos-10 minutos, ou até que a coloração desejada se revele. Lave com água deionizada e transfira para outra lavagem com água deionizada por 2 minutos em um placa agitadora.
• Faça a contra-coloração, desidrate e monte os slides como descrito nos procedimentos do sistema de coloração ABC.

E. Coloração Direta com Imunoperoxidase

• Para coloração direta de secções de tecidos com imunoperoxidase, recomenda-se o uso dos anticorpos primários conjugados com HRP da Santa Cruz Biotecnologia.
• Todos os passos deverão ser realizados em uma câmera umidificadora. Permita que todos os reagentes dos sistemas de coloração atinjam a temperatura ambiente antes da utilização dos mesmos. As secções de tecidos não deverão se ressecadas durante nenhum momento. Utilize sucção para remover os reagentes após cada procedimento, mas evite que os espécimes ressequem entre cada etapa. Use o reagentes em quantidades suficientes para cobrir todos os espécimes (em geral, aproximadamente 100 µl por slide é considerada uma quantidade adequada).
• Incube os espécimes por 1 hora em temperatura ambiente em soro bloqueador normal a 5% em PBS (Soluções-tampão e Soluções Gerais). O soro bloqueador (Soro Normal para Imunohistoquímica) deverá ser, preferencialmente, derivado da mesma espécie na qual o anticorpo primário é produzido. Remova o soro bloqueador dos slides.
• Incube com o anticorpo primário conjugado a HRP durante a noite à temperatura de 4° C. A concentração ideal do anticorpo deverá ser determinada por titulação; recomenda-se 2.0–8.0 µg/ml do anticorpo diluído em PBS com soro bloqueador normal a 5%. Lave com três trocas de PBS por 5–7 minutos cada lavagem.
• Acrescente 1–3 gotas do mistura do substrato de HRP. Revele por 30 segundos–10 minutos, ou até que a coloração desejada se revele. Lave com água deionizada e transfira para outra lavagem com água deionizada por 2 minutos em uma placa de agitação.
• Faça a contra-coloração, desidrate e monte os slides como descrito nos procedimentos do sistema de coloração ABC.