Plasmide CRISPR d'Activation (h) TRP2/DCT: sc-400334-ACT

La DCT humaine (dopachrome tautomérase), également appelée TRP2, est une enzyme mélanosomale qui catalyse la conversion du dopachrome en DHICA au cours de la biosynthèse de l’eumélanine. Elle fonctionne au sein du réseau mélanogénique tyrosinase/TRP1/TRP2 et contribue à la maturation des mélanosomes, à la qualité du pigment et à l’équilibre rédox dans les mélanocytes. L’expression de DCT est régulée par des programmes transcriptionnels de lignée tels que MITF et est liée à des réponses au stress cellulaire associées aux intermédiaires de la mélanine. L’activité et l’expression de TRP2/DCT, lorsqu’elles sont dérégulées, sont fréquemment étudiées dans les phénotypes de pigmentation et la biologie du mélanome, notamment en lien avec l’état de différenciation tumoral et des contextes de signalisation associés aux antigènes.

TRP2/DCT Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DCT sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TRP2/DCT Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DCT dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DCT, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TRP2/DCT. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DCT natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TRP2/DCT au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TRP2/DCT dans les cellules tumorales présentant une expression de DCT silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.