PDE10A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403981-ACT

O PDE10A humano codifica a fosfodiesterase 10A, uma fosfodiesterase de duplo substrato que hidrolisa cAMP e cGMP para ajustar a dinâmica da sinalização por nucleotídeos cíclicos. Ao modular o “tônus” de segundos mensageiros, o PDE10A regula a saída das vias de PKA e PKG, influenciando programas transcricionais dependentes de fosforilação, a atividade de canais iônicos e a sinalização sináptica. O PDE10A está fortemente implicado em redes de sinalização neuronal, nas quais a homeostase alterada de nucleotídeos cíclicos se associa à biologia de doenças neuropsiquiátricas e neurodegenerativas. Sua posição na via também o torna um ponto útil para estudar a comunicação cruzada entre a sinalização por GPCR, cascatas intracelulares de quinases e a expressão gênica dependente do contexto.

PDE10A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PDE10A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PDE10A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PDE10A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PDE10A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PDE10A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PDE10A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PDE10A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PDE10A em células tumorais com expressão de PDE10A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.