HSP 90 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400605-ACT

HSP90B1 codifica a GRP94, uma chaperona da família HSP90 do retículo endoplasmático que auxilia o dobramento, a maturação e o controlo de qualidade de proteínas secretadas e de membrana, incluindo integrinas e recetores do tipo Toll. Atua na resposta a proteínas mal dobradas (unfolded protein response, UPR) e nas vias de degradação associada ao RE (ER-associated degradation, ERAD) para manter a proteostase durante o stress celular. Ao regular a estabilidade e o tráfego das proteínas clientes, a GRP94 influencia a sinalização imunitária, a adesão celular e a biologia dos recetores de fatores de crescimento. A atividade desregulada de HSP90B1 e as respostas de stress do RE têm sido associadas à progressão tumoral, a fenótipos inflamatórios e a desequilíbrios de proteostase ligados à neurodegeneração, tornando-o um ponto útil para interrogação de vias em modelos de células humanas.

GRP 94 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HSP90B1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GRP 94 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HSP90B1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HSP90B1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GRP 94. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HSP90B1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GRP 94 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GRP 94 em células tumorais com expressão de HSP90B1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.