HSF1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400432-ACT

Hitzeschockfaktor 1 (HSF1) ist ein zentraler transkriptioneller Master-Regulator der zellulären Hitzeschockantwort, der unter Stress die Proteostase aufrechterhält, indem er Hitzeschockproteine und Co-Chaperone induziert, darunter die HSP70- und HSP90-Netzwerke. In menschlichen Zellen integriert HSF1 Signale proteotoxischen Stresses mit Programmen der transkriptionellen und translationalen Kontrolle und prägt so die Antworten auf oxidativen Stress, Proteinfehlfaltung und Umweltbelastungen. Die Aktivität von HSF1 überschneidet sich mit Signalwegen, die die Proteinqualitätskontrolle, Autophagie und zelluläre Überlebensentscheidungen steuern, und eine veränderte Regulation HSF1-assoziierter Stressprogramme wurde mit der Krebsbiologie sowie Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen in Verbindung gebracht. Die Modulation der HSF1-Expression ist daher nützlich, um Stressadaptations-Schaltkreise und das nachgeschaltete Remodeling des Transkriptoms in unterschiedlichen Zellmodellen zu untersuchen.

HSF1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HSF1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HSF1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HSF1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HSF1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HSF1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HSF1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HSF1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HSF1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HSF1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.