FAK CRISPR Activation Plasmid (m): sc-420280-ACT

Protein-Tyrosinkinase 2 (Ptk2) kodiert die fokale Adhäsionskinase (FAK), eine nichtrezeptorartige Tyrosinkinase, die Signale von Integrinen und Wachstumsfaktorrezeptoren integriert, um den Umsatz fokaler Adhäsionen und das Remodeling des Aktin-Zytoskeletts zu koordinieren. In Mauszellen reguliert FAK Zelladhäsion, Migration, Polarität und Überleben über Signalwege einschließlich PI3K–AKT, MAPK/ERK, Rho-Familien-GTPase-Signalisierung sowie SRC-abhängiger Phosphorylierungskaskaden. FAK ist außerdem in Mechanotransduktionsprogramme eingebunden, die die Steifigkeit der extrazellulären Matrix mit transkriptionellen Antworten und der zellulären Kontraktilität koppeln. Eine dysregulierte FAK-Signalisierung ist mit verändertem Gewebe-Remodeling, inflammatorischen Mikroumgebungen und invasiven Phänotypen assoziiert, wodurch Ptk2 in Modellen der Tumorprogression, Fibrose und Gefäßbiologie als Knotenpunkt breit untersucht wird.

FAK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ptk2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FAK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ptk2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ptk2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FAK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ptk2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FAK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FAK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ptk2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.