ERp57 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401497-ACT

PDIA3 codifica a ERp57, uma isomerase de dissulfeto de proteínas do retículo endoplasmático (RE) que coopera com a calnexina e a calreticulina para catalisar a formação e a isomerização de pontes dissulfeto durante a dobragem de glicoproteínas. A ERp57 contribui para a proteostase do RE, para o controlo de qualidade e para processos associados ao RE ligados à resposta a proteínas mal dobradas (unfolded protein response) e à dobragem oxidativa de proteínas. Para além do lúmen do RE, a PDIA3 tem sido implicada na apresentação de antigénios através do carregamento de peptídeos no MHC classe I e numa regulação mais ampla da sinalização de stress celular. A desregulação da atividade ou da expressão de ERp57 está associada a alterações na homeostase proteica e tem sido estudada no contexto de vias relacionadas com inflamação, neurodegeneração e cancro.

ERp57 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PDIA3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ERp57 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PDIA3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PDIA3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ERp57. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PDIA3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ERp57 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ERp57 em células tumorais com expressão de PDIA3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.