CD40 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400524-ACT

Humanes CD40 kodiert einen kostimulatorischen Rezeptor der TNF-Rezeptor-Superfamilie, der vor allem auf antigenpräsentierenden Zellen exprimiert wird, darunter B‑Zellen, dendritische Zellen und Makrophagen, wo er Signale von CD40L integriert und so die adaptive Immunität mitprägt. Die Bindung an CD40 aktiviert kanonische und nicht‑kanonische NF‑κB‑Signalwege, MAPK‑Wege sowie PI3K/AKT‑abhängige Programme, die Antigenpräsentation, Zytokinproduktion, Überleben sowie B‑Zell‑Proliferation und Klassenwechselrekombination regulieren. Über diese Signalwege beeinflusst CD40 die Dynamik der Keimzentren und T‑zell‑abhängige humorale Antworten; veränderte CD40‑Aktivität wurde mit Immunfehlregulation und entzündlicher Pathobiologie in Verbindung gebracht. Eine dysregulierte CD40‑Signalgebung ist zudem für die Tumorimmunologie und die Forschung an B‑Zell‑Malignomen relevant, da sie Aktivierungszustände von Zellen und die Kommunikation im Mikroumfeld mitsteuert.

CD40 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CD40-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CD40 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CD40-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CD40-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CD40-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CD40-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CD40-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CD40-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CD40-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.