ARK-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401568-ACT

AURKA codifica a quinase de serina/treonina ARK-1 (humana), um regulador associado ao centrossomo essencial para a entrada em mitose, a maturação do centrossomo e a montagem do fuso bipolar. A ARK-1 coordena a progressão do ciclo celular por meio da fosforilação de substratos associados ao fuso e aos microtúbulos e integra-se ao controlo do checkpoint mitótico para assegurar uma segregação cromossómica fiel. A atividade desregulada de AURKA compromete a estabilidade genómica e está frequentemente ligada a fenótipos proliferativos e à aneuploidia observados em diversos contextos da biologia tumoral. Como um nó central na sinalização relacionada com a mitose, AURKA é amplamente utilizada para investigar mecanismos de amplificação de centrossomos, dinâmica do fuso e respostas ao stress durante a divisão celular.

ARK-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AURKA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ARK-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AURKA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AURKA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ARK-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AURKA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ARK-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ARK-1 em células tumorais com expressão de AURKA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.