Amphiphysin II Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401263-ACT

BIN1 codifica l’amfifisina II, una proteina di rimodellamento delle membrane contenente un dominio BAR che coordina l’endocitosi mediata da clatrina, la biogenesi dei tubuli T ed eventi di traffico dipendenti dalla curvatura attraverso interazioni con la dinamina e con membrane ricche di fosfoinositidi. L’amfifisina II supporta la formazione di vescicole e l’organizzazione del citoscheletro, con ruoli dipendenti dal contesto nella funzione sinaptica neuronale e nell’architettura della membrana muscolare. Alterazioni dell’espressione e dello splicing di BIN1 sono state collegate a vie rilevanti per la miopatia miotubulare e la degenerazione neuromuscolare, e BIN1 è anche studiato in relazione ai cambiamenti nelle reti endocitiche osservati nella biologia delle malattie neurodegenerative. Queste funzioni rendono BIN1 un bersaglio utile per analizzare la dinamica delle membrane, la segnalazione dipendente dal traffico e la regolazione di isoforme specifiche per tipo cellulare in sistemi modello umani.

Amphiphysin II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BIN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Amphiphysin II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BIN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BIN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Amphiphysin II. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BIN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Amphiphysin II nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Amphiphysin II nelle cellule tumorali con espressione di BIN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.