Sistema CRISPR
Santa Cruz Biotechnology ofrece ahora plásmidos CRISPR/Cas9 Knockout (KO) específicos de diana, plásmidos CRISPR Double Nickase, plásmidos CRISPR/ dCas9 Activation y sistemas CRISPR Lenti Activation para más de 18.910 genes humanos y 18.340 genes codificantes de proteínas de ratón.
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Historia del CRISPR/Cas9
El sistema CRISPR/Cas9 es un mecanismo de defensa adaptativa utilizado por Archea y bacterias para degradar material genético extraño. En estos organismos, el material genético extraño de un bacteriófago es integrado en el loci CRISPR (1,2). Este nuevo material, también conocido como espaciador, genera un fragmento de secuencia especifica que será utilizado como resistencia contra futuras infecciones del bacteriófago. Estos fragmentos de secuencia especifica se traducen en CRISPR ARNs cortos (crRNAs) y funcionan como guía para dirigir la excisión del ADN invasor complementario, mediante actividad nucleasa de la proteína CRISPR- asociada (Cas) codificada también en el loci CRISPR (1,2). La nucleasea Cas9 del sistema CRISPR tipo II tiene un dominio de unión al ARN, y un lóbulo hélice alfa (REC), un lóbulo de nucleasa que incluye, RuvC y HNH para la escisión del ADN y un motivo adyacente protospacer (PAM) que interactúa con (1,2). crARN forma un complejo con la nucleasa Cas9 mediante unión de la hélice alpha con el Lóbulo REC y genera múltiples puentes con la columna de crARN (1,2,3).
Tras la unión de crRNA a Cas9 la conformación de la nucleasa Cas9 se modifica generando un canal que permite la unión al ADN (1,2,3). El complejo Cas9 / crRNA analiza el ADN en busca de un motivo PAM (5'-NGG) (4,5,6). El reconocimiento de un motivo de PAM induce un desenrollamiento del ADN que permite al crRNA buscar el ADN complementario adyacente al motivo PAM. Cuando Cas9 se une a un motivo PAM adyacente a una secuencia de ADN complementaria a la de crRNA, la hélice puente dentro del lóbulo REC crea un heterodúplex de ARN-ADN con el ADN diana (3,4,7). El reconocimiento del sitio PAM está implicado en la activación de los dominios HNH y RuvC lo que produce la rotura de la doble cadena (DSB) del ADN diana, esto lleva a la degradación del ADN (1,2,5,8) . Si el crRNA no es complementario, Cas9 se libera y busca otro sitio PAM (7). La rotura del ADN diana pueden ser reparado mediante el mecanismo conocido como Recombinación no homóloga (NHEJ), que introduce o elimina nucleótidos, generando errores, o a través de Recombinación homóloga (HDR), que puede ser utilizado para introducir marcadores en sitios específicos del genoma (2,9,10). Este mecanismo CRISPR /Cas9 puede ser utilizado en ingeniería genómica de varios sistemas, incluyendo las células de mamíferos.
Modificaciones en el Genoma tras la rotura de la doble cadena (DSBs) pueden realizarse con meganucleasas, Nucleasas con dedos de Zinc (ZF) ó transactivator-like effectors (TALEs), que reconocen secuencias de ADN, sin embargo cada uno tiene sus limitaciones. Las meganucleasas no permiten un reconocimiento especifico entre nucleasas y ADN (2). Las otras dos opciones, ZFs y TALEs, son difíciles de diseñar y reconocen un máximo de 3 nucleótidos de ADN (2). Las guias de ARN de una cadena (sgRNAs) que actúan como crRNAs son fáciles de diseñar y pueden expresarse junto con la nucleasa Cas9 en un mismo vector para hacer diana en secuencias especificas del ADN y realizar las modificaciones del genoma. El sistema CRISPR/ Cas 9 tiene además mayor sensibilidad y es más eficiente cuando se usa para detectar pequeñas horquillas de ARN.
Una gran ventaja de usar el sistema CRISPR/Cas 9 para generar un corte en el ADN genómico es la alta eficiencia. Sin embargo, esta eficiencia puede verse empañada por un efecto off- target que reduce la especificidad de la edición CRISPR/Cas 9. La especificidad puede mejorarse con el uso del sistema Doble Nickase CRISPR, mediante el cual un par de plásmidos, cada uno codificando una CAS9 (D10A) nickase mutante (Cas9n) que se dirigen a una región especifica y diferente mediante dos guias de ARN (12). Cada complejo Cas9n/sgARN corta una vez la cadena de ADN complementaria al ARN guia (12). Cada par de guías tiene una distancia de unas 20 pb y reconoce secuencias localizadas en las cadenas opuestas del ADN diana. El doble Nick con el par de Cas9n/sgARN imita un corte de Doble cadena en el ADN (12). Por lo que el uso de las pareja de ARN guia permite una mayor especificad mientras mantiene un alto nivel de eficiencia.
Además de la edición del genoma, el sistema CRISPR ha sido diseñado para permitir una robusta activación de la expresión génica endógena (13). Varios componentes del sistema CRISPR se han modificado para generar un complejo mediador de activación sinérgica (SAM), que resulta en un sistema de activación de la transcripción altamente eficiente y específico (13). Uno de los componentes del complejo SAM, que está modificado, es la nucleasa Cas 9. En el sistema SAM, los dominios catalíticos de Cas 9 han sido desactivados y la dCas 9 resultante se fusiona a un dominio de activación de la transcripción (VP64). Guiado por un ARN diana específico (sgRNA), el complejo dCas 9- VP64- sgRNA tienen como objetivo una región localizada a - 200 pb del punto de inicio de la Transcripción (TSS) de genes endógenos, que regulan al alza la expresión génica (13). Para incrementar aún más la transcripción, el sgRNA ha sido modificado, añadiendo una horquilla al tetra lazo y el bucle 2 (13). Esta horquilla del sgRNA se une selectivamente a proteínas dimerizadas de la envoltura del bacteriófago MS2 (13). La fusión de las proteina p65 y MS2 a los dominios de trans- activación HSF1 permiten que la fusion proteica MS2-P65-HSF1 mejore el reclutamiento de factores de transcripción, mejorando así la potencia de la activación de los genes, mediada por dCas 9 (13). Los productos para la Activación se ofertan como Plásmidos y Partículas Lentivirales para una mejor eficiencia de la integración del Sistema SAM de Activación de la Transcripción en la célula (13).
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Rotura de la doble cadena (DSB) dirigida por CRISPR/Cas9
