Plasmide CRISPR d'Activation (h) Nucleostemin: sc-402271-ACT

Le gène humain GNL3 code la nucléostémine, une protéine nucléolaire liant le GTP, enrichie dans les populations de cellules souches et progénitrices, qui aide à coordonner la biogenèse des ribosomes avec la progression du cycle cellulaire. La nucléostémine participe à la signalisation du stress nucléolaire et interagit avec des points de contrôle associés à p53 et à MDM2 afin de moduler la prolifération, la sénescence et la stabilité du génome. Par ces mécanismes, elle contribue à la régulation de l’auto-renouvellement, de la fidélité mitotique et des réponses cellulaires au stress oncogénique ou au stress de réplication. Une expression altérée de GNL3 a été associée à des programmes de croissance dérégulés dans de multiples contextes tumoraux et est fréquemment utilisée comme marqueur d’états cellulaires prolifératifs en recherche biomédicale.

Nucleostemin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GNL3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Nucleostemin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GNL3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GNL3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Nucleostemin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GNL3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Nucleostemin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Nucleostemin dans les cellules tumorales présentant une expression de GNL3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.