Plásmido CRISPR de Activación (h) VPAC2: sc-402062-ACT

El VIPR2 humano codifica el receptor VPAC2, un receptor acoplado a proteínas G de clase B para el péptido intestinal vasoactivo (VIP) y el polipéptido activador de la adenilato ciclasa hipofisaria (PACAP). VPAC2 se acopla principalmente a Gs para elevar el AMPc y activar programas transcripcionales dependientes de PKA, con efectos adicionales sobre la señalización MAPK/ERK y la dinámica del calcio según el contexto celular. Este receptor modula la comunicación neuroendocrina, la regulación circadiana y metabólica, y la actividad de las células inmunitarias al moldear la señalización de citocinas y la capacidad de respuesta celular a neuropéptidos. La desregulación de la señalización VIPR2/VPAC2 y las variaciones en el número de copias se han asociado con fenotipos neuropsiquiátricos y del desarrollo, y la actividad alterada de esta vía se ha estudiado en la biología de enfermedades inflamatorias y metabólicas.

VPAC2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de VIPR2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

VPAC2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus VIPR2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional VIPR2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de VPAC2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo VIPR2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de VPAC2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía VPAC2 en células tumorales con expresión de VIPR2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.