Plásmido CRISPR de Activación (h) VGAT: sc-401850-ACT

SLC32A1 codifica el transportador vesicular de GABA (VGAT), una proteína de la membrana de las vesículas sinápticas que carga GABA y glicina en vesículas secretoras para posibilitar la neurotransmisión inhibitoria. Al controlar la captación vesicular y el tamaño cuántico, VGAT regula el equilibrio entre excitación e inhibición, la plasticidad sináptica y las oscilaciones de las redes neuronales en todo el sistema nervioso central. La señalización inhibitoria alterada, asociada a una actividad desregulada de SLC32A1/VGAT, es relevante para estudios sobre epilepsia, fenotipos relacionados con la ansiedad, trastornos del neurodesarrollo y trastornos del movimiento, en los que la inhibición a nivel de circuito está alterada. Como transportador vesicular, la función de VGAT se integra con el ciclo de las vesículas sinápticas, el metabolismo de neurotransmisores y los procesos de transporte dependientes de gradientes iónicos que determinan la eficacia de las sinapsis inhibitorias.

VGAT El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SLC32A1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

VGAT El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SLC32A1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SLC32A1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de VGAT. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SLC32A1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de VGAT en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía VGAT en células tumorales con expresión de SLC32A1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.