UKHC Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402349-ACT

KIF5B codifica l’isoforma UKHC della catena pesante della chinesina-1, un motore basato sui microtubuli che alimenta, in modo ATP-dipendente, il trasporto anterogrado di vescicole, complessi proteici e organelli nelle cellule polarizzate. Coordinandosi con le catene leggere della chinesina e con gli adattatori del carico, KIF5B sostiene il traffico intracellulare, la dinamica del centrosoma e del fuso mitotico e l’organizzazione del citoscheletro, influenzando così processi quali la mitosi, la secrezione e il trasporto neuronale. Un’attività o un’espressione di KIF5B deregolate possono alterare la distribuzione degli organelli e la segnalazione, e KIF5B è spesso studiato nel contesto di fusioni geniche oncogeniche (ad es. KIF5B-RET) e di vie proliferative alterate. Queste caratteristiche rendono KIF5B un nodo utile per indagare i meccanismi di trasporto sui microtubuli, il controllo del ciclo cellulare e la segnalazione dipendente dal traffico in modelli cellulari umani.

UKHC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KIF5B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

UKHC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KIF5B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KIF5B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di UKHC. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KIF5B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da UKHC nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via UKHC nelle cellule tumorali con espressione di KIF5B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.