Tropomyosin α Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423481-ACT

Tpm1 codifica per la tropomiosina α, una proteina a coiled-coil legante l’actina che stabilizza l’actina filamentosa e determina le interazioni actomiosina nelle cellule striate e non muscolari. Regolando la meccanica dei filamenti sottili, l’organizzazione del citoscheletro e la trasmissione della forza contrattile, TPM1 contribuisce a processi quali il controllo della forma cellulare, la migrazione, la dinamica dell’adesione e la contrazione muscolare. La funzione di TPM1 si intreccia con le vie di rimodellamento del citoscheletro di actina, inclusa la segnalazione dipendente dalle GTPasi Rho e i programmi di assemblaggio sarcomerico. Alterazioni dell’espressione di TPM1 o dell’equilibrio tra isoforme sono state associate a difetti nell’organizzazione miofibrillare e nella fisiologia dei cardiomiociti, a supporto della sua rilevanza in modelli di cardiomiopatia e nei meccanismi di malattia del citoscheletro.

Tropomyosin α Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Tpm1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Tropomyosin α Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Tpm1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Tpm1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Tropomyosin α. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Tpm1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Tropomyosin α nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Tropomyosin α nelle cellule tumorali con espressione di Tpm1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.