Trichohyalin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401940-ACT

TCHH kodiert Trichohyalin, ein stark quervernetztes Strukturprotein, das in der inneren Wurzelscheide von Haarfollikeln sowie in differenzierenden Keratinozyten angereichert ist. Trichohyalin ist ein wichtiges Substrat für Peptidylarginin-Deiminasen und Transglutaminasen und unterstützt dadurch Citrullinierung und Isopeptid-Quervernetzungen, die die verhornte Zellhülle (cornified envelope) stabilisieren und die mechanischen Eigenschaften der epithelialen Barriere verstärken. Durch seine Einbindung in Keratin-Intermediärfilamente und das Keratinisierungsprogramm trägt TCHH zur Follikelmorphogenese, zur Architektur des Haarschafts und zur epidermalen Differenzierung bei. Eine dysregulierte Expression oder Verarbeitung von Trichohyalin wurde mit Haar- und Hautphänotypen in Verbindung gebracht, was es für Studien zur Follikelbiologie, zu Barrierestörungen und zu epithelialen Stressantworten relevant macht.

Trichohyalin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TCHH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Trichohyalin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TCHH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TCHH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Trichohyalin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TCHH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Trichohyalin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Trichohyalin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TCHH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.