TNAP Plasmide Double Nickase (h): sc-400784-NIC

ALPL codifica la fosfatasi alcalina tessuto-non-specifica (TNAP), un ectoenzima ancorato al glicosilfosfatidilinositolo (GPI) che idrolizza i monoesteri fosfati extracellulari, regolando l’equilibrio tra fosfato inorganico e pirofosfato. Degradando il pirofosfato, TNAP modula i processi di mineralizzazione e sostiene la corretta maturazione della matrice di ossa e denti, influenzando anche la segnalazione purinergica tramite la defosforilazione dei nucleotidi nel compartimento extracellulare. L’attività di ALPL/TNAP interseca vie che controllano l’omeostasi del fosfato e la calcificazione della matrice extracellulare, e un’alterazione della sua funzione è associata all’ipofosfatasia e a fenotipi di calcificazione patologica. In quanto enzima esposto sulla superficie cellulare con un output catalitico misurabile, TNAP rappresenta un nodo sperimentale maneggevole per studiare le relazioni genotipo-fenotipo nel metabolismo minerale e in modelli di differenziamento cellulare.

TNAP Il plasmide Double Nickase (h) consiste in una coppia di plasmidi ingegnerizzati per l'editing ad alta specificità del locus ALPL nelle linee cellulari human. Ciascun plasmide esprime una nickasi Cas9 D10A e un sgRNA distinto che prende di mira filamenti di DNA opposti all'interno di ALPL. Quando indirizzate verso siti adiacenti su filamenti di DNA opposti, le due nickasi generano tagli a filamento singolo sfalsati che insieme producono una rottura a doppio filamento sfalsata, richiedendo un'attività coordinata sul bersaglio da entrambe le guide. La rottura del DNA risultante viene risolta da vie di riparazione cellulare endogene, più comunemente attraverso la giunzione non omologa delle estremità (NHEJ), portando a inserzioni o delezioni che interrompono la funzione di ALPL. Richiedendo il coinvolgimento di due sgRNA nel locus bersaglio, l'approccio a doppia nickasi migliora la specificità dell'editing e fornisce una strategia CRISPR complementare per applicazioni in cui è desiderato un controllo aggiuntivo sulla precisione del targeting.

Per supportare l'identificazione efficiente delle cellule modificate, un plasmide codifica la GFP per la visualizzazione fluorescente delle popolazioni trasfettate, mentre il plasmide di accompagnamento porta un gene di resistenza alla puromicina per la selezione antibiotica. Insieme, queste caratteristiche supportano l'arricchimento efficiente delle popolazioni co-trasfettate e semplificano la convalida dei cloni con ALPL interrotto.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.