Thrombospondin 5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402797-ACT

COMP codifica la trombospondina 5, una glicoproteina matricellulare pentamerica altamente arricchita nella matrice extracellulare della cartilagine e che contribuisce alla fibrillogenesi del collagene, all’assemblaggio della matrice e alla meccanotrasduzione nei tessuti muscoloscheletrici. Attraverso interazioni con collagene, proteoglicani e recettori di membrana, la trombospondina 5 influenza l’adesione dei condrociti e le vie di segnalazione che coordinano la proteostasi del reticolo endoplasmatico e l’omeostasi della matrice extracellulare. La disregolazione o varianti patogene in COMP sono associate a displasie scheletriche e a fenotipi articolari degenerativi, collegando un’organizzazione alterata della matrice a una compromissione della funzione cartilaginea. In quanto regolatore associato alla matrice, COMP è ampiamente studiato nella biologia della cartilagine, nello sviluppo del tessuto connettivo e in modelli di rimodellamento della matrice extracellulare.

Thrombospondin 5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di COMP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Thrombospondin 5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus COMP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione COMP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Thrombospondin 5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus COMP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Thrombospondin 5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Thrombospondin 5 nelle cellule tumorali con espressione di COMP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.