STELLA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403261-ACT

DPPA3 (STELLA) è un fattore associato alle cellule germinali e alle fasi precoci dell’embrione, implicato nella regolazione epigenetica durante lo sviluppo preimpianto, inclusi il mantenimento degli stati di metilazione del DNA e la protezione delle impronte genomiche. Nelle cellule umane, STELLA è collegata all’organizzazione della cromatina e a programmi trascrizionali che supportano le transizioni di pluripotenza, la specificazione della linea germinale e la stabilità del genoma in contesti di sviluppo precoce. La sua attività è stata associata alla modulazione di vie dipendenti dalla metilazione del DNA e al coordinamento di reti geniche legate alla riprogrammazione. Pattern di espressione deregolati di DPPA3 sono stati riportati in studi su infertilità, anomalie dello sviluppo e rimodellamento epigenetico associato al cancro, rendendolo rilevante per indagini meccanicistiche sul controllo dello stato cellulare.

STELLA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DPPA3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

STELLA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DPPA3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DPPA3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di STELLA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DPPA3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da STELLA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via STELLA nelle cellule tumorali con espressione di DPPA3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.