SRp20 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401265-ACT

SRSF3 (SRp20) ist ein serin-/argininreiches Spleißfaktor-Protein, das das konstitutive und alternative Spleißen von prä-mRNA reguliert und dabei die Exon-Definition sowie die Auswahl von Spleißstellen in einem breiten Spektrum von Transkripten beeinflusst. Durch die Kopplung der RNA-Prozessierung mit Transkription und mRNA-Export trägt SRp20 zur Koordination von Genexpressionsprogrammen bei, die Zellzyklusprogression, Differenzierung und Stressantworten steuern. Seine Aktivität leistet zudem einen Beitrag zur Regulation auf Signalweg-Ebene in Netzwerken des RNA-Stoffwechsels, einschließlich der Funktion des Spleißosoms und der posttranskriptionellen Kontrolle von Transkripten, die Signal- und Chromatinregulatoren kodieren. Eine fehlregulierte SRSF3-Expression oder Spleißaktivität wurde mit aberranten Isoform-Landschaften in Verbindung gebracht, wie sie bei Krebs und anderen Erkrankungen mit veränderter RNA-Prozessierung beobachtet werden, was seine Relevanz für mechanistische Studien zu spleißabhängigen Phänotypen unterstreicht.

SRp20 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SRSF3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SRp20 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SRSF3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SRSF3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SRp20-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SRSF3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SRp20-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SRp20-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SRSF3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.