SNRK Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407320-ACT

La sucrose non-fermenting related kinase (SNRK) è una chinasi serina/treonina della famiglia delle chinasi correlate ad AMPK che integra lo stato energetico cellulare con programmi metabolici e di adattamento allo stress. SNRK è stata collegata alla regolazione della funzione mitocondriale, del metabolismo di lipidi e glucosio e della segnalazione infiammatoria, con ruoli riportati nella biologia endoteliale e cardiaca, nonché nell’omeostasi del tessuto adiposo. Attraverso un controllo dei suoi effettori a valle dipendente dalla fosforilazione, SNRK interseca vie che governano il sensing dei nutrienti, le risposte allo stress ossidativo e il rimodellamento cellulare. Alterazioni dell’attività o dell’espressione di SNRK sono state associate a fenotipi cardiometabolici e a meccanismi di malattia legati all’infiammazione, rendendola un bersaglio utile per analizzare le reti di segnalazione regolate dall’energia nelle cellule umane.

SNRK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SNRK senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SNRK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SNRK nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SNRK, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SNRK. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SNRK nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SNRK nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SNRK nelle cellule tumorali con espressione di SNRK silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.