Serine racemase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402360-ACT

Das menschliche SRR kodiert für die Serin-Racemase, ein pyridoxalphosphatabhängiges Enzym, das die Umwandlung von L-Serin und D-Serin katalysiert; D-Serin ist ein wichtiger Ko-Agonist von NMDA-Typ-Glutamatrezeptoren. Durch die Regulation der Verfügbarkeit von D-Serin beeinflusst die Serin-Racemase die exzitatorische Neurotransmission, die synaptische Plastizität sowie nachgeschaltete calciumabhängige Signalkaskaden in neuronalen und glialen Kontexten. Die SRR-Aktivität verknüpft den Aminosäurestoffwechsel mit der Redoxbiologie über Interaktionen mit Signalwegen, die oxidativen Stress und das zelluläre Energiegleichgewicht steuern. Eine veränderte SRR-Expression oder eine gestörte D-Serin-Homöostase wurde mit Mechanismen neuropsychiatrischer und neurodegenerativer Erkrankungen in Verbindung gebracht, wodurch SRR ein nützliches Ziel für Studien zur NMDA-Rezeptor-assoziierten Signalübertragung und zur metabolischen Regulation darstellt.

Serine racemase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SRR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Serine racemase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SRR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SRR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Serine racemase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SRR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Serine racemase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Serine racemase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SRR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.