saposin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401394-ACT

PSAP codifica la prosaposina, un precursore lisosomiale che viene processato proteoliticamente in saposine A–D, proteine attivatrici essenziali per le idrolasi degli sfingolipidi. Facilitando il catabolismo di glicosfingolipidi e ceramide, le saposine supportano la funzione del lisosoma, il turnover dei lipidi di membrana e l’omeostasi endolisosomiale, collegando PSAP alle vie dell’autofagia-lisosoma e alle risposte cellulari allo stress. L’alterazione del processamento della prosaposina o dell’attività delle saposine compromette il metabolismo degli sfingolipidi, portando a fenotipi di accumulo lipidico e a patologie cellulari associate alla neurodegenerazione. Di conseguenza, PSAP è ampiamente studiato in modelli di malattie da accumulo lisosomiale, mantenimento della mielina e infiammazione guidata da una segnalazione lipidica alterata.

saposin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PSAP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

saposin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PSAP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PSAP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di saposin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PSAP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da saposin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via saposin nelle cellule tumorali con espressione di PSAP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.