Rock-2 Plasmide di attivazione CRISPR (r): sc-437370-ACT

La Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2 (ROCK2; Rock-2) è una chinasi serina/treonina che agisce a valle di RhoA per regolare la contrattilità actomiosinica, la formazione di fibre di stress, la dinamica delle adesioni focali e il rimodellamento del citoscheletro. Attraverso la fosforilazione di substrati come la catena leggera della miosina e le chinasi LIM, ROCK2 integra la segnalazione Rho/ROCK con le vie che controllano la forma cellulare, la motilità, la retrazione dei neuriti e il tono della muscolatura liscia. Nei modelli di ratto, l’alterata attività di ROCK2 è spesso studiata nel contesto del rimodellamento vascolare, della fibrosi, della neuroinfiammazione e delle risposte al danno, in cui una tensione citoscheletrica anomala e la migrazione cellulare contribuiscono alla patologia. La segnalazione dipendente da ROCK2 è inoltre rilevante per la meccanotrasduzione e per transizioni di tipo epitelio-mesenchimale in diversi tessuti, a supporto del suo impiego come nodo per analizzare fenotipi guidati dalla contrattilità.

Rock-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (r) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rock-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (r) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione , dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rock-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rock-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rock-2 nelle cellule tumorali con espressione di silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.