Ribosomal Protein S19 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402405-ACT

RPS19 codifica la proteina ribosomiale S19, un componente essenziale della piccola subunità ribosomiale 40S che sostiene la biogenesi del ribosoma e un avvio accurato della traduzione. Oltre al suo ruolo strutturale nel ribosoma, RPS19 contribuisce alla maturazione nucleolare del pre-rRNA e si integra con i programmi cellulari di proteostasi e di risposta allo stress che collegano la sintesi proteica al controllo della crescita. L’alterazione della funzione di RPS19 compromette la differenziazione eritroide ed è fortemente associata all’anemia di Diamond–Blackfan e alla segnalazione di stress p53-dipendente legata alle ribosomopatie. In quanto gene housekeeping fondamentale, l’espressione di RPS19 viene utilizzata anche per valutare la capacità traduttiva, la funzione nucleolare e l’adattamento allo stress metabolico o genotossico in modelli cellulari umani.

Ribosomal Protein S19 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RPS19 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ribosomal Protein S19 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RPS19 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RPS19, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ribosomal Protein S19. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RPS19 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ribosomal Protein S19 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ribosomal Protein S19 nelle cellule tumorali con espressione di RPS19 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.