Plásmido CRISPR de Activación (h) Ribophorin II: sc-402599-ACT

RPN2 codifica la riboforina II, una subunidad esencial del complejo oligosacariltransferasa (OST) en el retículo endoplásmico rugoso que cataliza la glicosilación N‑ligada cotraduccional de polipéptidos nacientes. Al favorecer la maduración de glucoproteínas y el control de calidad del RE, la riboforina II influye en el plegamiento y el tráfico de proteínas, así como en las vías de proteostasis que se entrecruzan con la señalización de la respuesta a proteínas mal plegadas. La glicosilación dependiente de RPN2 alterada se ha relacionado con cambios en la composición de receptores de membrana y en la dinámica del proteoma de la superficie celular, lo que la hace relevante para estudios de adaptación al estrés y de señalización desregulada en modelos de enfermedad. En sistemas humanos, la perturbación de RPN2 se usa con frecuencia para investigar cómo la capacidad de glicosilación del RE condiciona la viabilidad celular, la adhesión y la respuesta a estímulos de distintas vías.

Ribophorin II El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RPN2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Ribophorin II El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RPN2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RPN2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Ribophorin II. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RPN2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Ribophorin II en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Ribophorin II en células tumorales con expresión de RPN2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.