rhodopsin CRISPR Activationプラスミド (h): sc-401026-ACT

ヒトのRHOは、杆体視細胞の外節ディスク膜に組み込まれた光感受性のGタンパク質共役受容体（GPCR）であるロドプシンをコードし、光受容変換（フォトトランスダクション）カスケードを開始します。光子を吸収するとロドプシンはトランスデューシンを活性化し、cGMPシグナル伝達を調節することで、環状ヌクレオチド作動性（CNG）チャネルの活性と、その下流である膜の過分極を制御します。これらは暗所視に不可欠です。RHOの発現とタンパク質ターンオーバーは、視覚サイクルにおける発色団（クロモフォア）の再生、外節への輸送、そしてGPCRの制御された不活性化など、網膜の恒常性維持プロセスと密接に結び付いています。RHOの機能不全や変異は遺伝性網膜変性と関連しており、網膜モデルにおけるGPCRシグナル伝達の機序解明、視細胞のストレス応答、ならびに遺伝子制御の研究における重要な標的となっています。

rhodopsin CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性RHOの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

rhodopsin CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における RHO 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はRHO転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性rhodopsinの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のRHO遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるrhodopsin依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびRHO発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるrhodopsin経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。