Rho T1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401601-ACT

RHOT1 codifica Rho T1 (Miro1), un’ATPasi/GTPasi atipica della famiglia Rho ancorata alla membrana mitocondriale esterna, che coordina il traffico, il posizionamento e il controllo di qualità dei mitocondri. Attraverso domini EF-hand leganti Ca2+ e interazioni con adattatori di chinesina/dineina, RHOT1 contribuisce ad accoppiare i mitocondri al trasporto basato sui microtubuli e regola la dinamica mitocondriale, l’omeostasi bioenergetica e la mitofagia, incluse le vie associate a PINK1/PRKN. Una funzione deregolata di RHOT1 è stata collegata a un’alterata distribuzione mitocondriale e a un turnover compromesso degli organelli, processi implicati nella neurodegenerazione, nelle neuropatie e in altri disturbi caratterizzati da stress mitocondriale. In quanto regolatore del trasporto mitocondriale, RHOT1 è spesso studiato in modelli neuronali, in paradigmi di stress ossidativo e in saggi dell’integrità della rete mitocondriale e della respirazione.

Rho T1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RHOT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rho T1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RHOT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RHOT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rho T1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RHOT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rho T1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rho T1 nelle cellule tumorali con espressione di RHOT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.