RBCK1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402044-ACT

RBCK1 (também conhecido como HOIL-1) codifica uma ligase E3 de ubiquitina que atua como um componente essencial do complexo LUBAC, catalisando a ubiquitinação ligada a Met1 (linear) para regular as vias de sinalização de NF-κB e MAPK. Por meio da montagem de cadeias lineares de ubiquitina em intermediários-chave de sinalização, o RBCK1 ajuda a coordenar respostas imunes inatas, sinalização inflamatória e decisões de sobrevivência celular a jusante de receptores como o TNFR e receptores de reconhecimento de padrões. O RBCK1 também contribui para vias de controle de qualidade proteica e para a regulação, dependente de ubiquitina, de processos relacionados à autofagia. A interrupção ou desregulação da atividade de RBCK1 tem sido associada a fenótipos de imunodeficiência e autoinflamação, bem como a características miopáticas e cardiomiopáticas, tornando-o relevante para estudos mecanísticos de homeostase imune e respostas ao estresse.

RBCK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RBCK1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RBCK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RBCK1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RBCK1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RBCK1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RBCK1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RBCK1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RBCK1 em células tumorais com expressão de RBCK1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.