Raftlin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-406009-ACT

RFTN1 codifica a Raftlin, uma proteína andaime associada a lipid rafts, enriquecida em células imunes, onde ajuda a organizar microdomínios de membrana que coordenam a sinalização proximal aos receptores. A Raftlin contribui para vias do receptor de células B (BCR) e de outros imunorreceptores ao regular a localização e a estabilidade de complexos de sinalização em rafts ricos em colesterol, influenciando programas transcricionais a jusante ligados a MAPK e NF-κB. Por meio dessas funções, RFTN1 é estudado no contexto da ativação imune, da dinâmica de sinalização de receptores de antígeno e da regulação de redes inflamatórias, com associações relatadas a fenótipos de doenças imunomediadas e a alterações na função de células imunes. Sua posição próxima à membrana o torna um nó útil para dissecar como a organização de rafts molda a transdução de sinais e as respostas celulares.

Raftlin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RFTN1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Raftlin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RFTN1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RFTN1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Raftlin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RFTN1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Raftlin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Raftlin em células tumorais com expressão de RFTN1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.