Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rab 27b: sc-403498-ACT

RAB27B code la petite GTPase Rab27b, un membre de la famille Rab qui régule les étapes du trafic membranaire nécessaires à l’arrimage, à l’amorçage et à la fusion des vésicules sécrétoires avec la membrane plasmique. Par ses interactions avec des protéines effectrices telles que les protéines de type synaptotagmine et des partenaires de liaison spécifiques de Rab27, Rab27b coordonne l’exocytose régulée, la maturation des granules et la libération du cargo dans des contextes sécrétoires et immunitaires. Cette voie contribue notamment à la sécrétion des granules denses plaquettaires, au trafic des vésicules endocrines et au contrôle de la libération de vésicules extracellulaires/exosomes, reliant RAB27B à la communication intercellulaire et à la signalisation du microenvironnement. Un trafic dépendant de Rab27b dérégulé a été associé à des programmes de sécrétion altérés dans des conditions inflammatoires et en cancérologie, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques de la sécrétion liée aux métastases, des interactions tumeur–stroma et de la modulation immunitaire.

Rab 27b Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAB27B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab 27b Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAB27B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAB27B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab 27b. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAB27B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab 27b au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab 27b dans les cellules tumorales présentant une expression de RAB27B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.