Plásmido CRISPR de Activación (h) PP2A-Aα: sc-400876-ACT

PPP2R1A codifica la subunidad andamiaje Aα de la fosfatasa de proteínas 2A (PP2A), una importante fosfatasa de Ser/Thr que ensambla subunidades catalíticas y reguladoras para dirigir la especificidad de sustrato y la localización subcelular. PP2A-Aα coordina la desfosforilación en redes centrales de señalización, incluidas MAPK/ERK, PI3K–AKT–mTOR, Wnt/β-catenina y el control de puntos de control del ciclo celular, influyendo así en la proliferación, la diferenciación y las respuestas al estrés. La alteración de la función de PPP2R1A o de la composición del holoenzima PP2A se asocia con una homeostasis aberrante de la fosforilación y con inestabilidad genómica, y las variantes de PPP2R1A se vinculan de forma recurrente con múltiples tipos de tumores. Este gen se estudia con frecuencia en contextos de regulación mitótica, señalización del daño en el ADN y modulación, mediada por fosfatasas, de vías oncogénicas.

PP2A-Aα El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PPP2R1A sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PP2A-Aα El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PPP2R1A en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PPP2R1A, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PP2A-Aα. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PPP2R1A y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PP2A-Aα en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PP2A-Aα en células tumorales con expresión de PPP2R1A silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.