PNGase CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m): sc-425553

Übersicht

Das murine Gen **Ngly1** kodiert die Peptid:N-Glykanase (PNGase), ein zytosolisches deglykosylierendes Enzym, das N‑gebundene Glykanreste von fehlgefalteten Glykoproteinen entfernt, die aus dem endoplasmatischen Retikulum retrotransloziert wurden. Diese Aktivität ist ein integraler Bestandteil des ER‑assoziierten Abbaus (ERAD), indem sie die Deglykosylierung mit dem Ubiquitin‑Proteasom‑Abbau koppelt und die Proteostase unter Stress durch die „unfolded protein response“ mitprägt. NGLY1 ist zudem an der Regulation der Prozessierung von NRF1/NFE2L1 beteiligt und verknüpft damit Deglykosylierung mit zellulären Anpassungsprogrammen, die die Expression von Proteasomgenen und die Stressresilienz steuern. Eine Störung der N‑Glykanase‑Funktion ist für Mechanismen proteotoxischen Stresses, der Proteinkontrolle/Proteinqualitätskontrolle und für neuroentwicklungsbezogene Phänotypen, wie sie in der NGLY1‑assoziierten Biologie beobachtet werden, breit relevant.

Das PNGase CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m) ist ein Pool von Plasmiden, die für die gezielte Disruption des Ngly1-Gens in mouse-Zelllinien entwickelt wurden. Jedes Plasmid koexprimiert eine einzigartige Single-Guide-RNA (sgRNA), die auf eine bestimmte Stelle innerhalb des Ngly1-Gens abzielt, zusammen mit der Streptococcus pyogenes Cas9-Nuklease. Die Plasmide kodieren zudem für GFP, was die fluoreszente Identifizierung und Anreicherung erfolgreich transfizierter Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie ermöglicht.

Das Multi-Guide-Design erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass Insertionen oder Deletionen (Indels) entstehen, die den offenen Leserahmen von Ngly1 nach der Cas9-vermittelten Bildung von Doppelstrangbrüchen unterbrechen. Durch das CRISPR/Cas9-System verursachte DNA-Brüche werden über endogene NHEJ-Wege (Non-Homologous End Joining) repariert, was häufig zu Frameshift-Mutationen führt, die die PNGase-Proteinexpression aufheben.

Dieses CRISPR-Knockout-System ermöglicht die effiziente Erzeugung von Ngly1-defizienten Zellmodellen zur Untersuchung der PNGase-Signalübertragung, für funktionelle Genomstudien, in der Krebsbiologieforschung sowie zur Bewertung therapeutischer Reaktionen in menschlichen Zelllinien.

Hauptmerkmale

• sgRNAs, die auf Ngly1-Exone abzielen, die für die PNGase-Funktion entscheidend sind
  Ko-Expression von SpCas9 und sgRNA aus einem einzigen Plasmid zur vereinfachten Verabreichung
  GFP-Reporter zur Identifizierung transfizierter Zellen
  Pool von Plasmiden, die auf mehrere Ngly1-Genomstellen abzielen, um die Knockout-Effizienz zu verbessern
  Kompatibel mit der Verabreichung durch Transfektion

Designvarianten

CRISPRs +/- HDRs

• gRNAs, die vom PNGase CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m) und vom PNGase CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m2) kodiert werden, zielen auf unterschiedliche Stellen innerhalb des Ngly1-Lokus ab. Es kann ein oder beide Targeting-Designs verfügbar sein. Siehe „Verwandte Produkte“ für Verfügbarkeit.
  HDR-Donorkonstrukte, kodiert durch das PNGase HDR-Plasmid (m) und PNGase HDR-Plasmid (m2) kodiert, enthalten eine Puromycin-Resistenzkassette und einen RFP-Reporter, flankiert von Ngly1-Homologiearmen, um die homologe Reparatur an definierten Ngly1-Zielstellen entsprechend den CRISPR/Cas9-KO-Designs zu unterstützen. Die Verfügbarkeit von HDR-Donoren kann variieren. Siehe „Verwandte Produkte“ für Verfügbarkeit.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.