PKC lambda/iota Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-422263-ACT

Prkci codifica a isoforma atípica da proteína quinase C, PKC lambda/iota, uma quinase de serina/treonina que atua como componente central do complexo de polaridade PAR e regula a polaridade ápico-basal, a divisão celular assimétrica e a organização das junções oclusivas. Em células de camundongo, a PKC lambda/iota integra sinais a montante de pequenas GTPases e do sinalização por fosfoinositídeos para coordenar a dinâmica do citoesqueleto, o tráfego vesicular e a migração direcional. Ela modula vias de sinalização de proliferação e sobrevivência por meio de rotas que convergem com as saídas transcricionais de PI3K–AKT, NF-κB e Hippo/YAP, influenciando a diferenciação e a arquitetura tecidual. A desregulação da atividade de PKC atípica tem sido associada a alterações na integridade epitelial, controle de crescimento aberrante e fenótipos ligados à inflamação, tornando Prkci um alvo útil para estudos mecanísticos em modelos de desenvolvimento, regeneração e doença.

PKC lambda/iota O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Prkci sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PKC lambda/iota O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Prkci em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Prkci, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PKC lambda/iota. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Prkci nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PKC lambda/iota no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PKC lambda/iota em células tumorais com expressão de Prkci silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.