Plasmide CRISPR d'Activation (h) PKC beta: sc-400263-ACT

PRKCB code pour la protéine kinase C bêta (PKCβ), une kinase sérine/thréonine sensible au diacylglycérol et au Ca2+ qui relaie des signaux provenant de récepteurs couplés à la phospholipase C. Dans les cellules humaines, PKCβ régule des réseaux de phosphorylation contrôlant les voies NF-κB et MAPK, le remodelage du cytosquelette, le trafic vésiculaire, ainsi que les décisions liées au cycle cellulaire et à la survie. L’activité de PRKCB est étroitement liée à la signalisation du récepteur des cellules B et des récepteurs Fc, et module la production de médiateurs inflammatoires ainsi que les réponses au stress oxydatif. Une signalisation PKCβ dérégulée a été impliquée dans une activation immunitaire aberrante et des programmes de signalisation oncogéniques, faisant de PRKCB un nœud utile pour étudier le remodelage contextuel des voies de kinases.

PKC beta Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRKCB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PKC beta Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRKCB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRKCB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PKC beta. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRKCB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PKC beta au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PKC beta dans les cellules tumorales présentant une expression de PRKCB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.